荧光定量PCR实验结果数据分析中遇到的可能问题汇总

以吗？不知道要怎么稀释比较好呢？

A：阳性对照和阴性对照必须要和样品一起提取，进行平行实验，这样才有作为对照的意义。临界阳性样品是不能通过阳性对照稀释的，除非你知道临界阳性的浓度，经过定量标定将阳性对照稀释到临界阳性。

Q：本人检测的目的基因共有5个处理，每个处理做两次重复，现在的问题每个处理内重复性非常差，有的Ct值差异达到了10，不知道是怎么回事？

A：换了一个退火温度把所有的设计好的引物都拿来重新试了一下，现在有一对引物两个温度都还好。基本上能够达到要求了。另外，我使用的是BIO-RAD的仪器，感觉边上跟中间温度差异挺大的，因为之前这对引物我也曾经试过的，但是放在边上一个，结果差异很大。经验教训啊！

Q：荧光量开始很高

A：根据TAKARA的资料说，这是因为摸板浓度过大了，把它再稀释，然后再做看看。是模板浓度过大引起的，可以看到曲线图中最高浓度的样品的Ct值很小。但是这张图也能用的，你调整一下基线范围，把背景荧光压下去，这样以来图就漂亮了就能分析了。

Q：刚做了一次real time PCR，结果解离曲线中出现了负值

A：这个曲线反应的是随着温度的变化荧光值的变化速率。值越高，则此时PCR产物荧光值变化越快，也就是说PCR产物变性速度最快。当温度达到Tm值时，PCR产物迅速变性，荧光值急剧下降，表现在这张图上就是出现一个峰。产物越纯，峰越窄，PCR产物越多，峰越高。这样看来，出现负值表明此温度下PCR产物变性速度没有两边的温度是快。70-80度时，已经出现变性，但是较为缓慢。但是你的产物看来不是特别纯，峰比较宽，可能要改变反映条件或者改变引物。