荧光定量PCR实验结果数据分析中遇到的可能问题汇总

A：如果是探针法，应该没有Ct值，所谓的没有，也是针对不同算法而言的。NTC一般没有明显的指数扩增，所以一般软件不计算Ct。 如果是染料法，可能在30个循环后有微弱起峰，并且软件计算出Ct值，这时还要观察溶解曲线，看扩增产物是否是引物二聚体。大多情况是二聚体，这时也可以优化条件，比如提高退火温度等。

如果是探针法，阴性对照起峰肯定是污染，如果是染料法，还要看溶解曲线：如果溶解曲线的Tm值在80度以下，那么很可能是引物二聚体；如果溶解曲线是双峰或更多峰，其中有与加模板后的扩增产物的Tm值相同的峰，那么就意味着存在污染。

Q：无结果，而用产物跑电泳条带很清楚，什么问题？

A：我也出现过此情况，后来发现是因为加样的时间太长了，荧光染料暴露时间太长了，荧光基团淬灭了，出现上述问题还有一种情况，那就是荧光PCR仪的荧光采取信号值太低，有时也不稳定。 如果你使用探针法，有荧光信号而没有求出Ct值，那么可能你的探针浓度有问题，可能太高或者太低了，可能改变探针浓度看看。 Q：最佳荧光采集温度

A：采集荧光的时机不是决定于温度，而是决定于采用的方法。

如果采用染料法，一般要在延伸阶段的末点进行检测，而72度延伸的效率最高，所以采用染料法时大多在72度检测。如果扩增产物中存在引物二聚体，也有采用更高的读板温度，比如76度、80度等，这时的读板温度与引物二聚体的Tm值相关。 如果采用TaqMan探针法，由于TaqMan探针是累积荧光，理论上说在任何步骤检测都可以，但目前TaqMan大多采用两步法，所以在退火的末点进行检测即可。

如果采用分子信标的方法，就要在退火的末点进行检测。

FRET探针法，要在退火时进行荧光检测。 如果采用

Q：标准曲线的讨论

A：有一点可以告诉你：样品浓度太高，beta-actin都是很高的，要漂亮就稀释1000倍后再做。浓度高，很容易导致污染。而且第一二个梯度没有分开啊。标准曲线的落点局限在15个循环以前，那样你得到的反应有效线性范围太窄，就是说要很高浓度的样品才适用你这标准曲线。

Q：定量PCR中，质粒作为标准分子为何要线性化

A：因为你要检测的目的基因如果不出意外的话，应该是线性的吧，而你用来定标准曲线的目的基因确是连接在环状的质粒上的。我想单从变性和复性的难易上就会有很大的区别，当然会对引物的结合等各方面造成影响，何况环状的空间构象和线性的空间构象上的差异了。

做标准曲线时的基本原则之一就是要尽量的模仿需要定量的基因所在的自然条件，所以说，如果做标准曲线时你可以有条件做到用和你要检测的基因一样的标准品做标准曲线的话，就不要选择把一段基因克隆到质粒上。但是一般情况下是很难做到的。楼上说的没有酶切效果