荧光定量PCR实验结果数据分析中遇到的可能问题汇总

A：1. 荧光定量的结果可以进行电泳检测。

2. 如果阴性有扩增，说明PCR体系被污染了，PCR污染是很可怕的，而且很难消除。

3. 结论根据原来定的标准下，比如原来设定ct>35为阴性，那当ct为36时就不要特意调整标准。确定其为阴性就可以了。

4. 阳性产物做模板ct较低，其原因是模板浓度较高，模板浓度的对数和ct成反比。所以，模板浓度越高，ct越低。

A：1. 产物是可以用来电泳的，不过由于定量PCR借助于荧光的作用灵敏度较高，电泳产物则一般条带不会很亮；

2. 产物的二次扩增在定量PCR中一般是不建议做的，原因很简单，片段太短了，还是那个问题，定量PCR是高灵敏度的，再二次扩增很难排除二聚体、PCR污染、操作误差等等因素，特别是污染，我们能排除的往往都只是你想到的，还有很多是一时想不到的；

3. 如果你是用标准的检测试剂盒，你只需要按说明书来就操作就可以，判断结果同样，如果你还想探究其中的阴性可能漏检的问题，你应该用其他方法，而不能用这个试剂盒了。

Q：通过前辈的介绍了解到：正常的ct值范围在18~30之间，ct值应是荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。如果正常情况下大于30应可以定为阴性。因为最近我也在用SYBR Green做实时定量PCR，所以也想向各位前辈请教一下有关Ct值的问题。我的结果中待测基因的Ct值大多在18~25之间，但唯独内参照的Ct值很低。第一次做时基本都在10左右，将模板稀释10倍后第二次的内参照的Ct值还是在12~14之间。以这样的数据分析会影响结果的准确度吗？或者还是将模板继续稀释，直到ct值都达到18~30之间呢。

A：没必要吧。一般ct超过30是不好，但要是三个重复都这样，也还是可以用的啊，每次都做阴性对照阴性对照ct为0，那ct30就肯定不是污染，而是基因表达量低或是模板太稀，内参ct为10~14都正常啊，没必要再稀释模板了，那样你的目的基因ct又要超过30了，不过内参ct太低，低于10也是不太好，结果可能会有偏差。 Q：real-time pcr结果可用来发文章的要求有哪些？

A：不用，但是在文章必须说明用电泳还是用溶解曲线检测过。论文中把你的实验方法说明白就可以了。简单的一个表示图，就可以发表了。不过REAL-TIME PCR 想用的话最好放溶解曲线图，一般外文杂志喜欢接受。

Q：不知道为什么这两天做荧光老不顺，荧光Ct在20以下产物检测很亮，而普通用mix酶跑PCR条带却很淡，难道是荧光定量的酶比较好的原因吗？另外我的NTC荧光在30多个循环的时候都有起峰，我用重开的一管新酶和新稀释的引物以及新水做，还是有起峰，实在是搞不懂了。求大家帮帮忙吧！

A：1. 一些公司荧光定量试剂盒的酶是比普通Tag酶要好，主要是可以防止引物二聚体产生，引物二聚体少了，扩增效率自然高了。

2. 也可能是你荧光定量的体系比你普通的PCR体系要优化，比如有些公司荧光定量mix中的Mg离子浓度要高于普通的PCR体系。

3. 可能是跑胶的问题。看看你的MARKER还和以前一样亮吗？

做荧光定量的短片段特别容易污染。可能是你的枪被污染了吧，是用的跑电泳的那把枪吗？如果在35个循环后起峰，污染不算严重。可以把荧光定量PCR的基线调节到恰好高过阴性对照。

Q：请问下现在的PCR荧光诊断试剂盒里面，国家规定都要求要有临界阳对照吗？这些对照品是不是一定要和样本一起提取呢？还有临界阳用阳性对照来稀释来得到可