荧光定量PCR实验结果数据分析中遇到的可能问题汇总

荧光定量PCR问题疑难解答（一）

Q：1. 这两天我做标准曲线，线性关系还行，R平方0.998。但是扩增效率只有80%，另外扩增曲线也不是太光滑。2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的，只有100-200左右。

A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大看看，或者就是扩增产物太少了。

1. PCR反应效率差：引物，试剂PCR条件的原因。

做realtime-pcr优化体系很重要，你的扩增效率低。可以增加Mg离子的浓度，如果其他条件都好了，还不行，那就是引物的原因，那你就只能重新设计引物了。 2. PCR中混入影响反应的物质：

模板提取方法需要改进

3. 样品稀释不准确：

正常情况10倍比稀释时，前后是相差3.32个循环。 这很重要，做标准曲线很多不好的时候，很多都是倍比稀释的问题，

Q：荧光定量PCR的灵敏度

A：对于染料法的荧光定量来说，Ct值在13~30之间比较准确，30~33之间需要再次确认，在以上范围内的置信度比较差。

Q：标准曲线要重复两三次吗?

A：没有人说做定量PCR标准曲线要重复两三次，只是用来做标准曲线的梯度点最好不要少于4个，否则标准曲线准确性不高。 Q：关于荧光定量标准曲线的制作

A：一般的仪器虽然声称能进行单拷贝检测，但如果不是特别设计的体系，很难做到100拷贝以下的准确定量，一般用来做标准曲线的最小浓度为1000拷贝，再往下可靠性就降低了，这不是稀释或其他什么问题，而是本身你选作标准曲线的浓度以及定量浓度最好不要低于1000拷贝，如果再低一点，100拷贝也勉强可以接受，否则即使你做出来，认可度也不会太高。

Q：溶解曲线高矮

A：Tm值相同，而峰高低有差异是表达丰度不同，同样的扩增产物也会出现Tm值有微小差异，一般差异在1度以内都可以接受。融解曲线的纵坐标表示荧光信号对温度的一阶负导数。

Q：定量PCR没有扩增

A：把定量PCR的产物跑个电泳，看看有无产物，如果电泳有条带，说明PCR是成功的，只是荧光信号没有读取到，这时要调整染料或探针的浓度（看你是染料法还是探针法）；如果电泳没有条带，那么还要在定量PCR仪上优化实验条件。虽然你在普通PCR仪上优化过条件，但换了定量PCR仪，由于两台仪器的升降温速度及温度精密度等指标存在差异，同样的条件做不出PCR也是可能的。