荧光定量PCR实验结果数据分析中遇到的可能问题汇总

如果你测的是拷贝数，重复性不好是很难避免的。我感觉用SYBR green作realtime的误差还是比较大的，它的优势在于灵敏度高，但如果想精确定量，还是比较困难的，只好重复很多次，或者多花钱买标记的引物，那个特异性最好。

Q：各位高手，今天第一次做完8个基因的相对荧光定量（ddct法），扩增时忘了做融解曲线了，现在是不是没法再做融解曲线了？（ABI7500）对于每个基因都作了NTC对照，结果显示NTC无扩增，这样能否说明引物设计得还可以，没有引物二聚体的产生？至于是否有非特异性产物，就必须得做融解曲线了？请帮忙指教一下啊

A：把你的定量PCR产物重新作融解曲线，只是新建立一个反应，反应条件按照融解曲线的条件设定就可以了，没必要重新作定量。Ct值25-29，融解曲线单峰；ntc无CT值，融解曲线无峰，就不用电泳了，可以肯定。模板量增加10倍，Ct值减小3.32Cycles。

Q：荧光阈值高，怎么改进？

A：阈值取决于基线，基线是3~13cycles左右的荧光信号值标准偏差10倍，可能是背景高，把模板纯化一下看看。要调整一下你的基线的起止循环数。一般开始的循环为2或3，中止循环为一次试验最早起峰的Ct-3，即如果一条曲线在第13个循环就已经起峰了，那么基线的中止循环可以设置为13-3=10。如果你的体系不存在问题，就可能是你的那次试验模板浓度较高，起峰早，导致的阈值线过高。 Q：荧光定量PCR检测灵敏度和线性范围的关系

A：一般大家认为的检测灵敏度即检测下限，可以理解为能检测到和准确定量的最低浓度(拷贝数)，而线性范围为能够检测的区间，即可以检测及分辨的最低浓度到最高浓度的数量级。但两者都与荧光定量PCR仪器及试剂体系相关。

Q：real time PCR CT值一般在多少后认为模板没扩增？

A：当进入对数期的循环数大于35个时，RealTime RT-PCR检测无效，基因没有表达；当进入对数的循环数在32-35个循环时，需要有至少3个重复才能判断是否能检测到基因的表达。

Q：正常情况NTC是不应该出现CT值的吗？