荧光定量PCR实验结果数据分析中遇到的可能问题汇总

A：和我以前做得没消除背景的曲线挺相像。很可能是试剂的问题，我用东洋纺的试剂也得到过类似的曲线，换了试剂就好了！探针设计的问题！还有反应液体试剂酶离子调整。

Q：标准曲线检测限

A：这是由于ABI仪器采用半导体加热，其边缘效应致使96孔加热模块的中央温度高，周边温度低。由于定量原理是通过已知浓度的标准品和未知样本之间的比较来进行的，所以各孔位的反应参数可比性决定了定量的准确性。在模板浓度低的时候ABI的仪器各孔位热循环不均导致的误差经过多个循环后被放大，最终影响定量结果的准确性。所以ABI仪器只能区分5000个拷贝和10000个拷贝的差异，而且必须用ABI的原装试剂才能达到此效果，如果将模板再稀释，就无法区分这2倍浓度差异了。 你加入起始模板数分别是1000、100、10copy/ul 的反应孔，模板浓度太低了，ABI7000仪器不能检测出来，建议用高浓度模板来做标准曲线。

虽然现在的定量PCR仪好多都宣称能做到单拷贝检测，但这个前提是非常苛刻的。需要模板、引物、体系、实验条件设置一切都是最优的情况下才可能做出来，而且一般还有比例。像一般低拷贝检测Ct值不准确的情况还是很正常的，不需要郁闷的说，大家都是这样。一般临床检测的下限不会低于100拷贝，所以你要考虑是不是真的要做低拷贝的检测，另外，当Ct值大于30的时候结果就存在很大的不可信性，要反复确认，而低拷贝的Ct值一般都会大于30。

Q：溶解曲线3个峰

A：如果出现引物二聚体，可以从实验条件和体系上加以优化，比如提高退火温度，降低引物浓度等。但如果非特异性的峰离目标产物的峰较近的话，那就需要重新设计引物了，从引物的设计上多做些考虑。可以先优化条件，如果没有用的话就试试改变引物。

引物二聚体的几个特征是溶解曲线的峰不明显，即峰不尖且不高，另外是溶解温度基本上低于80度。如果不符合上面的两个条件，基本上就是体系污染了。可以跑个电泳看看。

样本出现双峰，也可以按照上面的判断看看是否有引物二聚体还是非特异性扩增产物。

可以提高2度退火温度试试看，延长退火时间对于消除引物二聚体的作用不大。

基本上采用染料法的确容易出现引物二聚体，尤其是30个循环之后。如果提高退火温度后空白对照还是起峰，但Ct值在35之后，那就不要管他了，正常。 Q：