荧光定量PCR实验结果数据分析中遇到的可能问题汇总

A：你的实验结果其实很好，是初始模板浓度设置错了。

1. 以2倍梯度稀释的模板，Ct值的差异为1的时候扩增效率为100%，从标准曲线上来看，你的6个模板Ct差异（标准曲线横轴）还都在1以上一点，已经很好；

2. 你的模板是以2倍梯度稀释的，这样初始模板拷贝数的对数值每个浓度相差应该在0.3左右，从图中看，标准曲线的纵轴每个梯度相差在0.7左右，似乎你设置时初始模板的拷贝数是 按照5倍梯度设置的。你可以把Ct值取出来，根据初始模板自己做一个标准曲线看看，估计扩增效率可以达到90%以上。2倍梯度区分的很好！ Q：只要Ct值大于30都是阴性吗？一开始不用设定吗？

A：看你做什么检测了，还要与对照品比对才能定性分析。不过，一般Ct值大于30结果置信度降低，需要多次确认。

常规修饰基团分子量

5’-Biotin 405.45 3’-TAMARA 623.60

5’-(6 FAM) 537.46 3’-Dabsyl 498.49

5’-HEX 744.13 3’-(6 FAM) 569.46

5’-TET 675.24 3’-Amino Modifier C3 153.07

5’-Cy5 533.63 3’-Amino Modifier C7 209.18

5’-Cy3 507.59 3’-Thiol Modifier C3 154.12

荧光定量PCR问题疑难解答（三）

Q：溶解曲线出现三个峰，以为是引物合成问题，重新合成三次引物，溶解曲线仍为三个峰。产物经电泳证实却为一条带，为什么会出现这种结果？

A：我也曾经出现过这个问题，但是我是出现两个峰，后来跑电泳证实是引物二聚体，<100bp的地方隐约出现一个引物二聚体的条带，你跑电泳没有其他条带可能是电泳的灵敏度不够吧，还有引物产生二聚体也不一定只产生一种结构的二聚体啊，可能会产生其他结构的二聚体啊，建议你可以继续设计引物再试试，或者提高退火温度看看！ 你的单一条带是不是很宽啊？照图上看来你的非特异性的产物和你的目的产物差不多大。非特异性扩增的条带的Tm值和你的产物的还是有点接近。而且不一定是跑胶都能看到非特异性扩增的。我以前做完后跑胶都没有目的条带，但是扩增曲线还是不错，但是荧光值都比较低。实时定量还是很敏感的。

建议提高温度，如果没有目的条带，就试着调一下镁离子浓度。

Q：最近作Real-time PCR有几个问题请教：

1. 产物可以进行电泳检测吗？

2. 为什么阴性产物进行二次扩增也有较强的荧光信号（据Ct值可判为阳性）？且电泳似乎也有较亮的条带，无法与阳性产物区别。

3.在Ct值无法判断阴性或阳性的情况下（接近或略高于判定阴性值时，有扩增曲线，但Ct值较大如37、38）如何下结论？