荧光定量PCR实验结果数据分析中遇到的可能问题汇总

还行，那只是还行。荧光定量本来就是很容易受到很多因素影响的实验，当然是要求严点好了，当然如果你检测的基因本身就是环状的，那当然不用线性化了，那样反而不好了！

线性化比较麻烦：首先要酶切，保证完全酶切，才能全部线性化。然后要回收，质粒酶切后再回收容易被破坏，而且回收率也不是很高。第三，线性化的质粒不容易保存，相对于环状质粒来说。所以，如果有实验证据证明不线性化的质粒可以用，那就可以省去很多事情了。

Fig. 6 also shows the efficiency of the PCR reaction is not altered by using circular

plasmid DNA in place of linearised plasmid DNA.线形化与环状质粒比较文章

评论：这篇文章用这个质粒对线性化和非线性化做了比较，从实验结果看线性化并没有对标准曲线产生任何改变。但是这篇文章只是摆出了试验结果，并没有从原理上分析这个实验结果的原因，因此线性化对于标准曲线的作用并不能以这篇文章的结果来外推。就是说可能需要更多的实验结果，或者从原理上分析了这篇文章的结果，才能得出结论来说明，线性化确实对于所有,或大部分的质粒标准分子是不必要的。

荧光定量PCR问题疑难解答（二）

Q：realtime pcr不同基因之间的阈值(threshold)是不是要一样啊?

A：如果做标准曲线或者相对定量，建议阈值还是一样比较好。而且阈值一般要放置于扩增曲线的指数段，即荧光数据对数坐标轴下的线性段。如果扩增曲线的效率接近，阈值线的位置对于定量结果的影响是微乎其微的。

Q：扩增曲线本底不断升高是什么原因?

A：我近期也遇到过这种现象，现在基本解决了，原因可能如下：

1、试剂质量差是主要原因，我用ABI的SYBR试剂做了一年从来没有遇到过类似问题，而近期换成东洋纺的试剂就出现了这个问题，所以最好不要贪便宜用小鬼子的试剂！

2、模板不纯是一个重要原因，我用东洋纺的试剂出现问题后，用ddH2O稀释10倍以上（一定不要用TE稀释，要不然可能会更差），问题基本解决；

3、如果模板稀释后基线还有一定的上升，结果分析时可以将基线从6以上设，避开初始的几个上升厉害的循环；

建议：要根本解决此问题请用质量可靠的试剂，便宜没好货！

Q：分子信标做的阴性对照，曲线为一条斜线，什么原因？