荧光定量PCR实验结果数据分析中遇到的可能问题汇总

由于很多因素的影响，扩增子的溶解温度会有一定变异。溶解温度会受特殊缓冲液的pH值，所用Taq聚合酶，SG和MgCl2浓度和其他因素的影响。要做溶解曲线的对比你首先要确保所用的条件相同。

Q：SG的稳定性如何？

1周到3个月，这取 A：只要不进行稀释，SG是非常稳定的。一旦稀释，可以保存

决于冻融次数，推荐配置成一定浓度的贮存液，用时现用现配稀释液。

为优化SG反应，有必要在所有的常规步骤来确定，优化扩增反应的条件（合适的MgCl2、dNTP和Taq酶浓度等）。结果应该在凝胶电泳上有唯一的条带。 SG分析的优化主要包括以下4个因素：

a) SG 浓度 b) 引物浓度 c) MgCl2浓度 d) 温度和反应次数

推荐的SG终浓度变动范围是1：5000到1：100000。经常用到的浓度范围是1：10000到1：70000。引物浓度的优化应该测试不同浓度的正向和反向引物。引物浓度的范围应该是50nM到300nM，然而，也有例外的情况。

Q：荧光定量污染解决办法

A：几个月前我也有跟你一样的遭遇，当时跳楼的心都有。后来美国来人给培训，按照他们的要求，污染果真就给控制了，两个月来一直还很好。以下的经验希望对你有用。

1. 配反应体系和加模板要在不同的屋子进行；

2. 配体系的屋子准备一件干净的白大衣，每次进去都要记得换白大衣，至少要把别的屋子穿的白大衣脱掉；

3. 分装好体系以后把反应板/条放在一个有盖的干净的托盘中端到加样的房间；

4. 配体系戴的手套可以带到加样的房间，反过来不可；

5. PCR完毕后，反应产物拿到别的屋子扔掉；

6. 最重要的就是不要把DNA带到配体系的屋子，以上几点也都是为了这一目的。 Q：荧光定量real-timePCR重复性问题

1ul，而是稀释10倍左右然后加10ul，这样有助于改善重 A：建议不要只加

复性。