农杆菌介导的大豆子叶节非组织培养遗传转化体(8)

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植物遗传资源学报

［29］

13卷

3讨论

［20，30］［27，31］

，这已在拟南芥和油菜的

转化中得以证明。而本研究结果表明1次侵染比多

转化的几率

在大豆的遗传转化中，农杆菌介导的子叶节转

［21-23］

，但该方法在芽伸长和化是最常用的一种方法

生根方面存在着效率低和费时的难题。程云清等

发明了一种以大豆子叶节为受体不依赖组织

培养的大豆遗传转化新方法，该方法有效地解决了芽伸长和生根难的问题。本研究以传统子叶节原理为基础，探讨了蔗糖、表面活性剂、侵染方式、侵染次侵染液浓度及大豆基因型对转化效率的影响，优数、

化了农杆菌介导的大豆子叶节非组织培养遗传转化体系，并利用该体系对河北省优良大豆品种冀豆16号进行了Bar基因的遗传转化，植株再生率达71.2%，转化率为2.5%。

77是一种有机硅化合物，表面活性剂SilwetL-能够减少表面张力使菌体更容易进入植物的伤［24］［20］［25-26］［13］

、小麦萝卜和油口。在拟南芥、

77能的遗传转化研究中发现，使用SilwetL-［24］

首次证够提高农杆菌介导的转化效率。Liu等菜

77能够促进农杆菌明在共培养基中添加SilwetL-介导的大豆子叶节转化。而本研究的结果恰恰相77提高了转化效反，但B侵染方式使用SilwetL-率却与其相吻合。这可能是由于在结果2.1.1SilwetL-77的渗透作用被脱脂棉减弱，中，菌液更

多地被吸附在脱脂棉中而不能进入植株的伤口，使转化率降低；而在结果2.1.2中B侵染方式有

77发挥渗透作用，使转化率提高。利于SilwetL-77存在一定的毒性，另一方面由于SilwetL-其接

触的伤口处细胞因伤害太大而导致死亡，所以在结果2.1.1和2.1.2中出现了因添加SilwetL－77使转化效率和丛生芽得率降低的现象。

高渗培养基可以减少伤口处的细胞伤流液，使细胞内或液泡变小并发生一定程度的质壁分离，使农杆

［28］菌易于接触伤口周围的细胞，从而提高转化效率。本研究探讨了不同蔗糖浓度对转化效率的影响，结果［27］［16］

次侵染更利于农杆菌的转化，这可能是由于侵染次

数过多会使菌体存留太多、侵染时间太长，对细胞的伤害加重而导致死亡，从而使GUS阳性率和丛生芽得率都降低。

DNA的转移有极强的效侵染液浓度对T-［32］

应。本研究结果表明侵染液浓度为OD600=0.6时GUS阳性率最高，有利于农杆菌的转化。但随着

GUS在子叶节区的着色面积是侵染液浓度的增加，

逐渐增大的。这可能是由于侵染液浓度越大，农杆

DNA转其侵染子叶节区时有效的T-菌的密度越大，

移则越多，所以GUS在子叶节区的着色面积越大；

但是侵染液浓度过大，则导致子叶节区细胞的死亡，GUS所以能进行GUS瞬时表达的外植体数量减少，阳性率降低。

为了解决草铵膦筛选假阳性率高的问题，本研究首次使用针刺法对转化植株进行草铵膦筛选，并与叶片涂抹法进行筛选效率的比较，发现针刺法明显优于涂抹法。使用针刺法筛选时能够对草铵膦进行定量实施，而涂抹法在涂抹时不容易掌握草铵膦的量，涂抹面积和涂抹量不能准确把握；另一方面由于草铵膦是内吸式除草剂，它的有效成分经叶脉渗

［33］

入参与代谢，针刺法筛选时草铵膦更容易进入叶而涂抹法筛选时草铵膦进入叶脉易受气孔脉传输，

开度即蒸腾作用的影响。因此针刺法比涂抹法更准确，筛选效率更高。但是这种方法与涂抹法一样，受

［34］

叶龄的影响较大，使用该方法筛选时要掌握叶片叶龄的选择。

参考文献

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［2］［3］

表明3%的蔗糖浓度最适合此体系进行农杆菌转化。这一结果与一般的大豆子叶节转化法使用的蔗糖浓

［21-23］

。高浓度的蔗糖不利于转化可能是由于度一致

蔗糖浓度过高，渗透压过大会导致伤口处细胞脱水，

发生严重的质壁分离而导致细胞死亡，从而降低转化同时也不利于丛生芽的再生。效率，

农杆菌的转化是一个反复发生的过程，存活在植株体内的农杆菌的转化活力会随时间的推移而下降，反复浸染可以增加具转化活性的农杆菌数目及

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