农杆菌介导的大豆子叶节非组织培养遗传转化体(2)

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植物遗传资源学报13卷

难、转化率低的缺点，是一种高频、简单、快捷的非组织培养遗传转化途径。这种非组织培养的遗传转化、拟南芥白方法在其他作物的转化中如苜蓿、

［11-12］［13］［14］［15］

、萝卜、棉花、小麦等也得到了广泛菜

应用。程云清等

发明了一种以大豆子叶节为受

体不依赖组织培养的大豆遗传转化新方法，该方法是依据农杆菌介导的子叶节法建立起来的。本试验以河北省推广的优良大豆品种为材料，试图通过对来优化农杆菌影响转化效率的多种因素进行研究，

介导的大豆子叶节非组织培养遗传转化体系，为大豆分子育种研究打下良好的基础。

随着转基因生物安全越来越多的被人们关注，

［17］

除草剂草铵膦已成为大豆转化中常用的筛选剂，但在实际应用过程中一直存在着草铵膦筛选假阳性率高的问题。本试验通过比较叶片针刺法和涂抹法两种方法的筛选效率，以确立大豆子叶节非组织培

为今后大豆转化养遗传转化体系的有效筛选方法，植株的筛选奠定基础。

［16］

［8］

［9-10］

1.2.3

农杆菌介导的大豆子叶节转化生长在沙

A），土中的大豆苗萌发5d后（图1，用手术刀片切去

1片子叶，留取另1片子叶连同下胚轴，小心去除腋

B中箭头所并沿下胚轴方向轻划5～6刀（图1，芽，

示）。用镊子夹取适量脱脂棉放入配制好的农杆菌

菌液中润湿至饱和，将脱脂棉放置于伤口处进行侵染，然后将侵染的大豆苗用黑色塑料袋套好保湿（图1，C），25℃黑暗条件下共培养3d。1.2.4

农杆菌介导的大豆子叶节非组织培养转化

体系优化研究多种因素对转化效率的影响试验在1.2.2和1.2.3的基础上对影响转化效率的多种因素进行研究，分别设置以下5个试验，所有试验均进行3次重复，每次重复每个处理外植体数≥30。77：以冀豆16蔗糖浓度和表面活性剂SilwetL-号为材料，侵染液分为不添加和添加0.01%～77两种，0.03%的SilwetL-同时二者分别又设置3%、5%和10%3个不同浓度的蔗糖处理，用此侵染液进行子叶节的转化，重复侵染3次，每天1次。

侵染方式：以冀豆16号为材料，设计3种侵染方式，见表1，重复侵染3次，每天1次。侵染次数：以冀豆16号为材料，侵染时分别设1、2和3次重复处理。

侵染液浓度OD600：以冀豆16号为材料，共设计4个侵染液浓度即OD600=0.2、0.4、0.6和0.8，分别用这4个浓度的侵染液进行侵染。

大豆基因型：以冀豆7号、冀豆16号和五星1号为材料。

表1

不同侵染方式的侵染液组成及操作方法

Compositionofinfectionmediumandoperationmethodfordifferentwaysofinfection

侵染方式WaysofinfectionABC

侵染液组成及操作方法Compositionofinfectionmediumand

operationmethod

77，侵染液附加3%蔗糖，不添加SilwetL-以脱脂棉作为菌液附着介质

77，侵染液附加3%蔗糖，同时添加SilwetL-滴加菌液至伤口处

77，侵染液附加3%蔗糖，同时添加SilwetL-滴加此菌液至伤口处，待菌液完全渗入再以脱脂棉作为菌液附着介质，使只附加3%蔗糖不添加Sil-wetL-77的菌液附着于伤口

1

1.1

材料与方法

试验材料植物材料

1.1.1

供试大豆［Glycinemax（L．）

Merr．］为河北省优良大豆品种：高蛋白品种冀豆7号和冀豆16号，脂肪氧化酶缺失品种五星1号。上述3个大豆品种的土培萌发率较高，可以提供较多的可用外植体，由河北省农林科学院粮油作物研究所提供。

1.1.2

农杆菌菌株和质粒农杆菌菌株为EHA105，质粒为pCAMBIA3301，该质粒带有GUS报

告基因和抗除草剂草铵膦Bar基因。1.2试验方法1.2.1

大豆种子的萌发选取成熟饱满、无病斑的播种于塑料花盆中，温室（光照强度大豆种子，

Table1

10000lx，14h光照/10h黑暗）25℃萌发5d后，待子

叶变绿并稍稍展开时用于子叶节的转化。1.2.2

农杆菌菌液的制备从含有50mg/L利福

平和50mg/L卡那霉素的YEB平板上挑取已转入质

粒pCAMBIA3301的农杆菌EHA105单菌落，接种于50ml含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃，180r/min震荡培养过夜。将培养好的菌液（OD600=0.6）3000r/min离心10min收集菌体，1/2MS；3%蔗弃上清，用侵染液［糖；1.67mg/LBA；200μmol/L乙酰丁香酮（As）；8.8mmol/L半胱氨酸（L-Cys）；1.0mmol/L二硫苏糖醇（DTT）；pH5.4］重悬菌体至OD600=0.6。

GUS基因在子叶节区瞬时表达的检测GUS

瞬时表达分析可以作为外源基因进入受体细胞的指

［18］示，因此以共培养3d后GUS在子叶节区的瞬时