农杆菌介导的大豆子叶节非组织培养遗传转化体(5)

5期表2

李丹丹等：农杆菌介导的大豆子叶节非组织培养遗传转化体系优化793

77对GUS阳性不同蔗糖浓度和表面活性剂SilwetL-率的影响

EffectofdifferentconcentrationsofsugarandsurfactantSilwetL-77onthepercentageofGUSpositive

蔗糖浓度（%）Concentrationsofsugar3510

外植体总数Totalofexplants1099792102102103

GUS阳性率（%）PercentageofGUSpositive44.05±1.66a28.74±2.44b11.94±1.73c10.74±0.93c11.67±1.44c9.66±0.76c

性率降低的情况。不同侵染方式试验表明（表3），

使用A组侵染液及操作方式时获得最高的丛生芽GUS阳性率为43.53%；使用B组得率达61.66%，

侵染液及操作方式时获得最高的GUS阳性率为61.94%，但其丛生芽得率较低仅为26.77%；使用C组侵染液及操作方式时GUS阳性率和丛生芽得率均为最低。以上结果表明选择A组侵染液及操作方式既能保证一定的GUS阳性率，也能获得较高的丛生芽得率。2.1.3

重复侵染次数对转化效率的影响侵染方

式A的GUS阳性率较低只有43.53%，可能是由于重复侵染3次对伤口处细胞的伤害太大造成的。因

Table2

处理Treatment不添加SilwetL-77

添加SilwetL-77

3510

表中数据均来自3次重复试验，小写字母代表5%的差异显著水平，多重比较采用LSD法。下同

Thedatainthetableweredevivedfromthreerepeatedexperiments．Smalllettermeanssignificantdifferenceat5%levelbyLSD．Thesameasbelow

2和3次不此为了确定最适侵染次数，分别进行1、

同次数的侵染，试验表明，在只进行1次侵染的条件下分别获得了最高的GUS阳性率（62.13%）和丛生芽得率（73.14%），均显著高于2次和3次侵染时的GUS阳性率和丛生芽得率（表3）。

2.1.4不同侵染液浓度对转化效率的影响

表3

表3不同因素对丛生芽得率和GUS阳性率的影响

EffectofdifferentfactorsontheregenerationrateofmultipleshootsandthepercentageofGUSpos-itive

Table3

显示，当侵染液浓度为OD600=0.6时，获得最高的GUS阳性率61.00%且显著高于其他处理。同时GUS染色结果表明，GUS随着侵染液浓度的增加，在子叶节区的着色面积逐渐增大。当OD600=0.8

GUS染色面积最大，时，但其GUS阳性率却低于OD600=0.6时的比率。所以，最终确定侵染液浓度为OD600=0.6时适于本转化体系。2.1.5

不同大豆基因型对转化效率的影响利用

上述已优化了的转化体系对3种基因型大豆进行转

因素Factors蔗糖浓度（%）Concentrationsofsugar侵染方式Waysofinfection侵染次数Timesofinfection侵染液浓度（OD600）Concentrationsofinfectionmedium大豆基因型Soybeangenotypes

处理Treatments

3510ABC1230.20.40.60.8J-16J-7WX-1

丛生芽得率（%）Regenerationrateofmultipleshoots60.40±2.83a50.45±1.75b46.82±1.06b61.66±3.96a26.77±3.49b15.21±1.71c73.14±2.30a67.36±1.20b61.31±1.34c

———————

GUS阳性率（%）PercentageofGUS

positive———43.53±1.76b61.94±1.73a18.26±1.41c62.13±2.59a53.01±1.34b43.24±3.10c27.58±1.58d40.82±2.62c61.00±2.30a54.85±1.69b61.79±1.56a18.67±1.77b13.37±1.17c

化。从表3中可以看出，冀豆16号的GUS阳性率为61.79%，显著高于冀豆7号和五星1号。不同基因型之间GUS阳性率的差异如此之大，也许与不同基因型所要求的转化条件不同有关，但根本原因可能还是由于冀豆16号为易感大豆基因型所致。2.2冀豆16号T0转基因植株的PCR检测采用已优化了的子叶节非组织培养转化体系对冀豆16号进行遗传转化，获得的再生植株经过除草剂草铵膦筛选后，提取抗性T0转基因大豆叶片的基因组DNA，用GUS引物和Bar引物分别进行PCR扩增。以pCAMBIA3301质粒作为阳性对照，非转

PCR结果显示，化大豆植株作为阴性对照，分别扩A）和Bar（图3，B）基因相应的增得到了GUS（图3，

大小分别为1019bp和300bp，同一植株上均条带，

扩增出两条条带的为阳性植株。在所有筛选得到的除草剂抗性植株中，两对引物的PCR扩增结果均呈T0PCR阳性率为8.3%。阳性的共有10株，

2.1.2

不同侵染方式对转化效率的影响表面活

性剂有较强的渗透能力，在侵染液中添加SilwetL-

77等物质往往可以代替抽真空操作［20］。但是用脱

77的渗脂棉作为菌液附着介质可能会降低SilwetL-透能力，且这种操作方式因菌液与伤口的作用时间

较长而对伤口处的细胞伤害较大，最终出现GUS阳