农杆菌介导的大豆子叶节非组织培养遗传转化体(3)

5期李丹丹等：农杆菌介导的大豆子叶节非组织培养遗传转化体系优化791

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表达为依据，通过计算GUS阳性（GUS）率来研究不同因素对农杆菌转化效率的影响。共培养结束

化率=（Bar阳性中GUSPCR阳性数/转化植株

。数）×100%］1.2.7

T1转基因植株的RT-PCR检测对

T1PCR检测呈阳性的转基因植株进行RT-PCR检

测。利用TaKaRa公司的RNAisoPlus试剂提取大

切取带有一部分子叶和一部分下胚轴的子叶节区后，

以非转基因的外植体作外植体进行GUS染色检测，

为阴性对照。先将切取的外植体用蒸馏水清洗3遍

以去除农杆菌，用滤纸吸干水分后将外植体浸泡在X-gluc染液［50mmol/LPBSpH7.0（50mmol/LNaH2PO4；50mmol/LNa2HPO4），10mmol/LNa2EDTA，0.1%（v/v）TritonX-100，0.5mmol/L铁氰化钾，0.5mmol/L亚铁氰化钾，20%（v/v）甲醇，1g/LX-gluc］中，于37℃染色24h，去除染色液，依次用70%、80%、90%和100%的乙醇梯度脱色，实体显微镜（O-LYMPUSSZX16）下观察并拍照。记录GUS在子叶节

GUS阳性区表达的外植体数并计算GUS阳性率［

率=（GUS在子叶节区表达的阳性外植体数/染色总

。外植体数）×100%］1.2.5

转化芽的诱导和植株再生共培养结束后D），用浓度为3.34mg/L的BA将塑料袋揭去（图1，

豆叶片总RNA，然后以TaKaRa公司的反转录试剂

盒进行反转录得到双链cDNA，以cDNA为模板进PCR检测。分别用Bar1、Bar2和GUS1、行RT-GUS2（GUS1：5'-CGACGGCCTGTGGGCATTCA-3'；GUS2：5'-TGGTCGTGCACCATCAGCAC-3'）引物进行PCR，反应体系及反应条件同1.2.6。GUS1、GUS2引物退火温度为65.2℃，72℃延伸1min15s，扩增产物长度为900bp。1.2.8

叶片针刺法和涂抹法草铵膦适宜筛选浓度的摸索以非转基因大豆为试验材料，进行两种方法适宜筛选浓度的摸索。共设计6个草铵膦50、100、150、200、250mg/L。待分别为0、浓度，

大豆植株第2片3出复叶完全展开且第3片3出此时叶片较嫩，分别用以上6复叶还未展开时，

7d后观察叶片及植株的个浓度进行针刺和涂抹，

生长情况。每个浓度处理12株植株，每个处理

重复3次。

针刺法：用1.0ml的微量注射器吸取一定量配

缓慢推动注射器柄当针头处水制好的草铵膦溶液，

滴将要自然滴下时（约0.02ml），在叶片偏上部主叶

脉两侧分别进行针刺，使水滴覆盖在针刺后叶片留下的小孔上方。7d后观察叶片及整个枝条的变化。

涂抹法：用棉签蘸取配制好的草铵膦溶液，在叶片的中心区域进行均匀涂抹。7d后观察叶片及整个枝条的变化。1.2.9

叶片针刺法和涂抹法对转基因再生植株进

行草铵膦筛选转化再生芽生长约两周后，在每个

水溶液浸润脱脂棉后置于子叶节部位，再套白色透

E），置于光照下25℃诱导培明塑料袋保湿（图1，

养。诱导7～9d后待子叶节部位长出丛生芽（图1，

F中箭头所示），揭去白色塑料袋和脱脂棉进行正常培养。10d后丛生芽即可伸长并长成枝条（图1，G），3～4个月即可获得转基因后代（图1，H）。1.2.6

T0/T1转基因植株的PCR检测

采用

CTAB法提取大豆叶片基因组DNA［19］，用GUS基因引物和Bar基因引物进行PCR鉴定。引物序列分

CATCGCAGCGTAATGCTCTA-3'；别为GUSF1：5'-GUSR1：5'-AACGTATCCACGCCGTATTC-3'，Bar1：5'-ACGCTCTTGAAGCCCTGT-3'；

Bar2：

5'-GCAC-CATCGTCAACCACT-3'。PCR反应体系为20μl，其dNTP1μl，中10×TaqReactionBuffer2μl，引物各

0.5μl，TaqDNAPolymerase0.3μl，大豆基因组DNA1μl，去离子水14.7μl。PCR反应条件：94℃预变性8min；94℃变性1min，复性45s（GUS引物Bar引物退火温度为62.2℃），退火温度为63℃、

72℃延伸（GUS引物为1min15s、Bar引物为50s），35个循环；72℃延伸10min。GUS引物的扩增产

Bar引物的扩增产物长度为物长度为1019bp、

300bp。PCR产物采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进PCR阳行检测。最后对T0转基因植株的再生率、

性率和转化率进行计算［再生率=（再生植株数/转化植株数）×100%；PCR阳性率=（Bar阳性中GUSPCR阳性数/草铵膦抗性植株数）×100%；转

枝条上任意选取1片3出复叶进行草铵膦的针刺和涂抹。7d后观察叶片及枝条的生长情况，保留抗性枝条并去除阴性枝条。对草铵膦抗性植株取样进行Bar基因的PCR检测，计算筛选效率［筛选效率=（Bar基因PCR阳性植株数/草铵膦抗性植株

。数）×100%］

2

2.1

结果与分析

农杆菌介导的大豆子叶节非组织培养遗传转化体系的优化

2.1.1

77对转化蔗糖浓度和表面活性剂SilwetL-效率的影响GUS阳性率统计结果见表2和表3，