人结肠癌裸鼠原位移植瘤模型的建立

疗药物对肿瘤细胞的抑制率（inhibitionrate），根据不同浓度药物的抑制率作出抑制曲线，计算5-FU和L-OHP对5株结肠癌细胞株的半数抑制浓度（50%inhibitionconcentration，IC50）。

2．6无血清培养（serumfreemedium，SFM）结肠癌干细胞

将SW480重悬至含20ng/mlEGF，10ng/mlbFGF，10ng/mlLIF，B27（1：50）和2mmol/LL-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基（serum-freemedium，SFM），接种于超低贴壁培养瓶（ultralowattachmentflask），放入5%CO237℃恒温培养箱培养进行悬浮培养。待SW480形成典型干细胞球（Tumorspherecells）后，收集结肠癌干细胞。

2．7免疫磁珠分选（Magnetic-activatedcellsorting，MACS）

贴壁培养SW480加入0．25%胰酶消化，收集约108细胞重悬于含22．4g/L葡萄糖、0．5%BSA的0．01MPBS缓冲液中，按CD44、CD166干细胞分离试剂盒说明书依次加入人Ig、半抗原耦联的抗CD44、CD166单克隆抗体、抗半抗原结合的免疫磁珠进行孵育标记，然后将细胞缓慢通过固定于磁场的分离柱收集CD44或CD166阳性细胞，洗脱的即为CD44、CD166阴性细胞。结肠癌干细胞CD44+、CD166+亚群。 2．8RealtimePCR定量扩增

采用总RNA提取试剂盒（TRIZOLreagent）分别提取结肠癌细胞株、结肠癌干细胞以及结肠癌干细胞CD44+、CD166+亚群总RNA，进行逆转录反应

（reversetranscription，RT）获取目的基因的cDNA，同时对不同细胞药物代谢相关基因进行定量PCR扩增，比较不同细胞株中药物代谢基因的表达差异。

2．9统计学处理

应用SPSS13．0软件，不同细胞株之间药物代谢相关基因mRNA表达水平、化疗药物IC50的不同采用单向方差分析（One-wayANOVA）进行比较。5-FU和L-OHP的IC50与药物代谢相关基因mRNA表达水平相关性分析采用spearman双变量相关分析。SW480和CSCs、CD44+SW480和CD44-SW480、CD166-SW480和CD166+SW480中药物代谢相关基因mRNA表达差异均采用独立样本t检验（IndependentsamplesT-test）比较。P<0．05具有显著统计意义。 结论：

1、结肠癌中药物代谢相关蛋白TS，TP，GST-π，Pgp，MRP1表达普遍，体外药敏实验证实结肠癌中TS、TP、Pgp的表达水平与5-FU的化疗敏感性呈负相关，而GST-π、Pgp、TP的表达水平则与L-OHP化疗敏感性呈负相关。因此，在结肠癌化疗前采用RealtimePCR或免疫组化检测肿瘤组织中药物代谢相关蛋白表达水平，对于临床医生选择相对敏感的化疗方案，对结肠癌患者进行个体化治疗具有重要的指导作用。

2、结肠癌干细胞及CD44+亚群中不同程度高表达MRP1、TP，提示结肠癌干细胞逃避化疗药物杀伤可能是结肠癌患者化疗失败，导致肿瘤进展的根本原因。进一步研究针对结肠癌干细胞的靶向杀伤药物，对于提高结肠癌治疗反应率，改善患者预后具有里程碑式的意义。

9.学位论文 杨绮华 结肠癌肝转移p53基因治疗磁共振疗效监测的动物实验研究 2008

研究背景：

结肠癌是严重危害人类健康和生命的主要肿瘤之一，对于结肠癌的治疗，现在对早期发现的病例仍多以外科手术作为首选，但目前结肠癌就诊时多数患者已处于中晚期。对于肝转移患者，仅10％可行手术5，但术后复发率较高，而化疗、放疗、免疫等治疗的副作用较大，效果也有限。通过恢复抑癌基因的功能来抑制肿瘤的发展或恢复其正常细胞表型的抑癌基因的基因治疗10为这些患者治疗提供了一个新选择。p53基因，作为重要的抑癌基因之一，文献报道其突变与50％的人类恶性肿瘤相关11.12。现p53的基因治疗以重组人p53腺病毒(rAd-p53)研究最多，进展最快，并且已经应用于部分肿瘤的治疗，目前对于结肠癌以及结肠癌肝转移治疗也已经开始进行研究。对于肿瘤的治疗效果的评价，我们需要一种客观的影像评价手段，但目前的超声、磁共振、CT等检查方法，均主要从形态学观察肿瘤的变化，对于肿瘤接受非手术治疗(化疗、放疗、基因治疗等)后的变化，显示往往不够敏感。若需要早期监测非手术治疗后肿瘤的变化，则需要一种能从代谢或从分子水平了解肿瘤情况的影像检查手段。 研究目的：

1、体外分析rAd-p53对结肠癌细胞的影响，探明p53基因治疗对肿瘤的治疗效果。 2、建立结肠癌肝转移的标准荷瘤裸鼠模型，供影像成像研究、其他实验研究使用。

3、探讨利用现有条件进行荷瘤裸鼠MR成像的方法，包括普通MRI成像以及弥散加权成像(DWI)，评估DWI在基因治疗早期疗效监测的价值。

4、比较经静脉注射、瘤内直接注射两种方法的基因导入效果，初步研究rAd-p53最佳导入途径，为进一步的扩大实验和临床应用的基因导入方法提供依据。

材料与方法：

1、rAd-p53对人结肠癌细胞的体外药敏试验

选用p53突变型的人结肠癌SW480细胞株，rAd-p53选用深圳赛百诺公司生产的重组人p53腺病毒注射液(注册名为今又生)。以不同效靶比(0～300)的rAd-p53转染肿瘤细胞SW480，72h后以MTT法测量光吸收值(OD值)，得出不同效靶比转染时的生长抑制率，从而选定一个较有效的转染效靶比。然后用此效靶比按照同样方法再次转染肿瘤细胞，72小时后以流式细胞术行细胞凋亡检测以及细胞周期分析。 2、SW480结肠癌荷瘤裸鼠模型的建立

种瘤鼠的制备采用培养细胞移植法，皮下注入SW480细胞悬液。

荷瘤鼠制备：约2周后种瘤鼠成瘤后，取种瘤鼠皮下肿瘤切成相同大小的组织块， …… 此处隐藏：1964字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……