人结肠癌裸鼠原位移植瘤模型的建立

疗药物对肿瘤细胞的抑制率（inhibitionrate），根据不同浓度药物的抑制率作出抑制曲线，计算5-FU和L-OHP对5株结肠癌细胞株的半数抑制浓度（50%inhibitionconcentration，IC50）。

2．6无血清培养（serumfreemedium，SFM）结肠癌干细胞

将SW480重悬至含20ng/mlEGF，10ng/mlbFGF，10ng/mlLIF，B27（1：50）和2mmol/LL-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基（serum-freemedium，SFM），接种于超低贴壁培养瓶（ultralowattachmentflask），放入5%CO237℃恒温培养箱培养进行悬浮培养。待SW480形成典型干细胞球（Tumorspherecells）后，收集结肠癌干细胞。

2．7免疫磁珠分选（Magnetic-activatedcellsorting，MACS）

贴壁培养SW480加入0．25%胰酶消化，收集约108细胞重悬于含22．4g/L葡萄糖、0．5%BSA的0．01MPBS缓冲液中，按CD44、CD166干细胞分离试剂盒说明书依次加入人Ig、半抗原耦联的抗CD44、CD166单克隆抗体、抗半抗原结合的免疫磁珠进行孵育标记，然后将细胞缓慢通过固定于磁场的分离柱收集CD44或CD166阳性细胞，洗脱的即为CD44、CD166阴性细胞。结肠癌干细胞CD44+、CD166+亚群。 2．8RealtimePCR定量扩增

采用总RNA提取试剂盒（TRIZOLreagent）分别提取结肠癌细胞株、结肠癌干细胞以及结肠癌干细胞CD44+、CD166+亚群总RNA，进行逆转录反应

（reversetranscription，RT）获取目的基因的cDNA，同时对不同细胞药物代谢相关基因进行定量PCR扩增，比较不同细胞株中药物代谢基因的表达差异。

2．9统计学处理

应用SPSS13．0软件，不同细胞株之间药物代谢相关基因mRNA表达水平、化疗药物IC50的不同采用单向方差分析（One-wayANOVA）进行比较。5-FU和L-OHP的IC50与药物代谢相关基因mRNA表达水平相关性分析采用spearman双变量相关分析。SW480和CSCs、CD44+SW480和CD44-SW480、CD166-SW480和CD166+SW480中药物代谢相关基因mRNA表达差异均采用独立样本t检验（IndependentsamplesT-test）比较。P<0．05具有显著统计意义。 结论：

1、结肠癌中药物代谢相关蛋白TS，TP，GST-π，Pgp，MRP1表达普遍，体外药敏实验证实结肠癌中TS、TP、Pgp的表达水平与5-FU的化疗敏感性呈负相关，而GST-π、Pgp、TP的表达水平则与L-OHP化疗敏感性呈负相关。因此，在结肠癌化疗前采用RealtimePCR或免疫组化检测肿瘤组织中药物代谢相关蛋白表达水平，对于临床医生选择相对敏感的化疗方案，对结肠癌患者进行个体化治疗具有重要的指导作用。

2、结肠癌干细胞及CD44+亚群中不同程度高表达MRP1、TP，提示结肠癌干细胞逃避化疗药物杀伤可能是结肠癌患者化疗失败，导致肿瘤进展的根本原因。进一步研究针对结肠癌干细胞的靶向杀伤药物，对于提高结肠癌治疗反应率，改善患者预后具有里程碑式的意义。

9.学位论文 杨绮华 结肠癌肝转移p53基因治疗磁共振疗效监测的动物实验研究 2008

研究背景：

结肠癌是严重危害人类健康和生命的主要肿瘤之一，对于结肠癌的治疗，现在对早期发现的病例仍多以外科手术作为首选，但目前结肠癌就诊时多数患者已处于中晚期。对于肝转移患者，仅10％可行手术5，但术后复发率较高，而化疗、放疗、免疫等治疗的副作用较大，效果也有限。通过恢复抑癌基因的功能来抑制肿瘤的发展或恢复其正常细胞表型的抑癌基因的基因治疗10为这些患者治疗提供了一个新选择。p53基因，作为重要的抑癌基因之一，文献报道其突变与50％的人类恶性肿瘤相关11.12。现p53的基因治疗以重组人p53腺病毒(rAd-p53)研究最多，进展最快，并且已经应用于部分肿瘤的治疗，目前对于结肠癌以及结肠癌肝转移治疗也已经开始进行研究。对于肿瘤的治疗效果的评价，我们需要一种客观的影像评价手段，但目前的超声、磁共振、CT等检查方法，均主要从形态学观察肿瘤的变化，对于肿瘤接受非手术治疗(化疗、放疗、基因治疗等)后的变化，显示往往不够敏感。若需要早期监测非手术治疗后肿瘤的变化，则需要一种能从代谢或从分子水平了解肿瘤情况的影像检查手段。 研究目的：

1、体外分析rAd-p53对结肠癌细胞的影响，探明p53基因治疗对肿瘤的治疗效果。 2、建立结肠癌肝转移的标准荷瘤裸鼠模型，供影像成像研究、其他实验研究使用。

3、探讨利用现有条件进行荷瘤裸鼠MR成像的方法，包括普通MRI成像以及弥散加权成像(DWI)，评估DWI在基因治疗早期疗效监测的价值。

4、比较经静脉注射、瘤内直接注射两种方法的基因导入效果，初步研究rAd-p53最佳导入途径，为进一步的扩大实验和临床应用的基因导入方法提供依据。

材料与方法：

1、rAd-p53对人结肠癌细胞的体外药敏试验

选用p53突变型的人结肠癌SW480细胞株，rAd-p53选用深圳赛百诺公司生产的重组人p53腺病毒注射液(注册名为今又生)。以不同效靶比(0～300)的rAd-p53转染肿瘤细胞SW480，72h后以MTT法测量光吸收值(OD值)，得出不同效靶比转染时的生长抑制率，从而选定一个较有效的转染效靶比。然后用此效靶比按照同样方法再次转染肿瘤细胞，72小时后以流式细胞术行细胞凋亡检测以及细胞周期分析。 2、SW480结肠癌荷瘤裸鼠模型的建立

种瘤鼠的制备采用培养细胞移植法，皮下注入SW480细胞悬液。

荷瘤鼠制备：约2周后种瘤鼠成瘤后，取种瘤鼠皮下肿瘤切成相同大小的组织块，经皮切开种植在裸鼠肝脏，定期观察，待肿瘤长至一定大小后进行治疗。

3、荷瘤裸鼠分组以及给药

将45只裸鼠随机分成9组，每组5只，第1～3组：空白对照；第4～6组：鼠尾静脉给药；第7～9组：肿瘤直接给药导入rAd-p53；每隔24小时在三个不同的给药组各选出1组进行MR扫描，扫描后立即处死并且取肝脏标本做病理检查。 4、影像检查

磁共振成像设备：Philips Gyroscan Intera 1.5T超导型磁共振扫描仪，使用C3线圈(内直径11cm，外直径14cm)。常规扫描TlWI横断位，T2WI横断位、矢状位以及冠状位。DWI采用横断位扫描，DWI序列所用的b值为0、400s／mm2，扫描后重建ADC图测量肿瘤的ADC值。 5、荷瘤裸鼠肝脏肿瘤标本的病理检查方法

病理HE染色切片，TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒检测肿瘤细胞的凋亡情况；应用WESTERN BLOT的方法检测p53的表达情况。然后对各注药组进行比较，初步定出基因治疗结肠癌肝转移时rAd-p53的最佳导入途径。将各注药组的病理结果与DWI检查结果结合分析，评价DWI检查对于基因治疗后早期疗效监测的应用价值。 6、统计方法

采用SPSS13.0统计软件包，P<0.05为有统计学意义。(1)对体外药敏试验MTT比色法的光吸收值资料采用单因素方差分析，不同效靶比组的两两比较行最小有意义差异(1east significance difference,LSD)-t检验。(2)对SW480荷瘤裸鼠模型各给药组肿瘤体积大小、磁共振DWI的ADC值、HE切片所见的肿瘤坏死范围、TUNNEL法检测所见的肿瘤细胞的凋亡比率以及WESTERN BLOT检测的p53的表达情况的对比采用完全随机化设计资料的K-W秩和检验，同一时间点的各给药组以及同一给药组各时间点的两两比较采用Wileoxon秩和检验。 结论：

1、rAd-p53对p53基因突变的人结肠癌SW480细胞株的生长有一定的抑制作用，其抑制作用主要是通过诱导SW480细胞的凋亡以及阻滞细胞厨期，使细胞停留在G0-G1期，不能进入S期而达到的。

2、通过肝内移植肿瘤的方式可以建立SW480荷瘤裸鼠的模型，rAd-p53的导入可以通过引起SW480结肠癌肝转移瘤的肿瘤坏死、肿瘤细胞的凋亡，对肿瘤起一定抑制生长的治疗效果。

3、rAd-p53的导入有多种方式，瘤内给药无论在引起肿瘤细胞的坏死、凋亡以及p53在肿瘤内的表达方面，效果都明显比静脉给药好，说明瘤内给药靶向性较强，为有效的导入方式。

4、磁共振弥散加权成像(DWI)可以从分子水平探测肿瘤内部的变化，从而可以应用于监测基因治疗后早期结肠癌肝转移瘤的变化，评价疗效。在瘤内给药后24以及48小时，由于治疗引起肿瘤细胞以及周围细胞的细胞毒性水肿、细胞膜功能障碍等原因以及当时p53基因的表达尚未达峰等原因，ADC值没有明显变化；而到给药后72小时，由于细胞毒性水肿逐渐消退，p53表达达峰，肿瘤细胞坏死、凋亡、崩解等所引起的ADC值的升高变得明显。

10.期刊论文 程鑫.曲林涛.张仕状.王滨.潘小杰 多鼠MRI观察小鼠结肠癌移植瘤内皮抑素疗效的实验研究 -临床放射学杂志2008,27(10)

目的 探讨用多鼠磁共振成像(multiple-mouse MRI,MMMRI)方法评价内皮抑素对小鼠结肠癌皮下移植瘤疗效的价值. 材料与方法建立小鼠结肠癌皮下移植瘤模型24只,1周后筛选成瘤均匀的16只随机分成两组:实验组与对照组.分别给予内皮抑素6 mg/(kg·d)及0.9%生理盐水各0.2 ml皮下注射,用药14天