百合ACC氧化酶基因全长cDNA的克隆及序列分析

4期 刘鲜艳,等:百合ACC氧化酶基因全长cDNA的克隆及序列分析

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2 结果与分析

2.1 RACE产物的分析

改进的SDS/酚法提取百合花瓣的总RNA,利用紫外光吸收法测定RNA的浓度和OD值,浓度达到500ng/ L,OD260nm/OD280nm值为1.8.电泳图片显示,28S与18S比为2 1(图1),所以利用这种方法,提取的RNA不仅浓度高而且纯度好,完全能够满足下一步RACE的需要.

参照RACE试剂盒说明书,以逆转录分别合成的3!RACE Ready cDNA和5!RACE Ready cDNA为模板,GSP与UPM(10%UniversalPrimerAMix)为引物,分别进行5!RACE和3!RACE扩增(图2).以3!RACE Ready cDNA为模板,GSP1与UPM为引物扩增得到约840bp条带.以5!RACE Ready cDNA为模板,GSP2与UPM为引物扩增得到约450bp的条带.以5!RACE Ready cDNA为模板,以GSP1、GSP2为引物扩增到与预期大小相同的约150bp的条带.

上述产物经回收后,连接克隆载体pGEM Teasy,转化大肠杆菌,蓝白斑筛选,随机挑取1~2个阳性克隆,小量提取质粒,分别进行质粒PCR检测

和EcoR#酶切鉴定(图3).结果表明,含3! RACE和5! RACE产物的重组质粒均能检测到预期大小的片段.经鉴定为阳性的重组质粒送公司测序.2.2 全长cDNA片段的获得

测序结果经DNASTAR软件去除污染载体,并将3!RACE和5!RACE所得到的序列进行拼接,设计1对该拼接序列的特异引物,PCR扩增后,得到与预期大小相同的约1200bp的条带(图4).然后将PCR产物回收,连接到pGEM Teasy,操作同2.2,进行质粒PCR检测和EcoR#酶切鉴定,结果表明重组质粒均能检测到预期大小的片段(图5),经鉴定为阳性克隆的重组质粒送测序,测序结果分析与拼接结果一致.