百合ACC氧化酶基因全长cDNA的克隆及序列分析(2)

RNA或RNAi技术把百合ACC氧化酶基因片段导入到百合优良品种中,可以在一定程度上抑制或干扰其内源ACO基因的表达,从而抑制乙烯的生物合成,进而延缓切花衰老,使百合的保鲜期得以延长.目前国内外报道的克隆ACO基因主要是在黄杉(PseudotsugasinensisDode.)[3]、甘蔗(Saccharumof ficinarumL.)[4]、仙人掌(OpuntiacompressaMacb.)、柿果(DiospyroskakiThunb.)等植物中,观赏植物仅见康乃馨(DianthuscaryophyllusL.)[7]和矮牵牛(PetuniahybridaVilm.)[8]等,而百合中从未见有所报道.

RACE(rapid amplificationofcDNAends)主要用特异引物和公用引物从低丰度转录本中快速扩增已知cDNA片段旁侧的5!和3!末端的简单而有效的方法,具有快捷、方便、高效等优点,成为目前克隆全长基因的一个常用方法.本研究在前期工作的基础上,采用BDSMARTTMRACEcDNAAmplifi cationKit,克隆百合ACO基因的cDNA全长,并进行序列比对分析,以期为ACO生化性质的研究与进一步利用基因工程手段实现品种改良奠定基础.

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总RNA样品中的DNA的去除参照张今今等[10]的方法.

1.2.2 百合ACO基因cDNA片段3!端和5!端的扩增 RACEcDNA扩增采用BDSMARTTMRACEcD NAAmplificationKit(BDBiosciencesClontech),方法按照在说明书的基础上稍加改良.

(1)RACE引物设计及扩增反应根据前期工作获得的EST核心序列(GenBank登录号DQ062133),利用Primer5.0软件设计基因特异引物GSP1(3!RACE引物)5! CCGTCACCTCCCCACCTC CAACAT 3!,和GSP2(5!RACE引物)5! CCTTCT TCAAATACCCTTTCTCCAACCC 3!.2个引物之间重叠区为150bp,GSP1与GSP22个引物扩增的产物作为对照.按ClontechSmartRACE试剂盒说明操作,采用15 L体系,各组分按比例缩减.循环参数为94 30s,(94 30s,68 30s,72 3min)35个循环,72 10min.

(2)RACE产物的克隆测序 1.5%琼脂糖凝胶回收3!RACE和5!RACE扩增产物,连接pGEM Teasy载体,转化E.coliTop10感受态细胞,蓝白斑筛选阳性菌落,培养后提取质粒DNA,分别进行质粒PCR检测以及EcoR#酶切鉴定,确定为阳性克隆后送公司测序.应用DNASTAR软件去除载体污染序列,将5!RACE和3!RACE测序结果拼接,将所得到的序列在NCBI的Blast进行比对.

1.2.3 ACO基因cDNA全长的获得及生物信息学分析据RACE已得到的序列,利用Primer5.0软件设计基因特异引物ACO R:5! TCTTTGGAGTT GTGGTATGTGGTT 3!,与ACO F:5! CCGTCAC CTCCCCACCTCCAACAT 3!;15 L反应体系包括5! RACE readycDNA0.75 L,ACO R0.3 L,ACO F0.3 L,dNTPMix0.3 L,10%BDAdvantage2PCRbuffer1.5 L,50%BDAdvantage2PolymeraseMix0.3 L,PCR Gradewater11.55 L;循环参数同1.2.2(1),退火温度60 ,克隆测序.利用DNAS TAR软件分析测序结果的序列与拼接结果的序列.最终将所得到的序列在NCBI的Blast进行比对,核苷酸序列的相似性比对在NCBI的Blastn(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastn)中分析,并确定开放阅读框分析(ORF),将其推导相应的氨基酸序列.蛋白质氨基酸相似性比对在NCBI的Blastp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastp)中分析;同样,运用Mega软件对推导的氨基酸序列与已知[11]

1 材料和方法

1.1 材料

亚洲百合 Polyanna 购于西安花卉市场,参照郝福玲等[9]的方法将半开花瓣存于-80 冰箱中.RACE试剂盒购自Clontech公司,pGEM TEasyVector购自Promega公司,限制性内切酶EcoR#为TaKaRa公司产品,测序由上海生工完成.1.2 方法

1.2.1 百合花瓣RNA的提取采用改进的SDS/酚法,称取0.1g样品,在液氮条件下研成粉末,迅速转入到已加入800 L裂解液[SDS质量分数为1%;EDTA(5mmol/L);Tris碱(20mmol/L);NaCl(200mmol/L)]与50 L 巯基乙醇的2mL的离心管中,充分混匀,4 、12000r/min,离心15min;取上清,加入等体积的酚氯仿异戊醇(25 24 1)和等体积的氯仿,混匀,4 、12000r/min,离心15min;取上清,加入1/3体积的KAc(5mol/L),混匀,4 、12000r/min,离心15min;取上清,加入等体积的酚氯仿异戊醇和等体积的氯仿,混匀,4 、12000r/min,离心15min;取上清,加入1/3体积的LiCl(8mol/L),-20 沉淀2h以上,4 、12000r/min,离心15min;弃上清,75%的乙醇洗涤2次,30 L的DEPC水.