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5期 宋健坤等：沙田柚杂种胚性愈伤组织的诱导及遗传鉴定 985

伤组织的诱导对其资源研究、品种改良均具有重要价值。【前人研究进展】目前，柑橘胚性愈伤组织的诱导已在柑橘属中的甜橙、酸橙、宽皮橘、柠檬、黎檬、葡萄柚，金柑属中的山金柑，近缘属植物中的指橘属、九里香属、非洲樱桃橘属，杂种中的橘柚、橘橙中的不同基因型获得成功[1]。这些柑橘愈伤组织有很多都是从败育胚中诱导获得的，沙田柚由于受其基因型的影响，从其幼胚很难直接获得愈伤组织，仅有少量通过其它途径获得愈伤组织的报道，如王大元等曾经用沙田柚的胚乳诱导出了三倍体的沙田柚愈伤[2]，Huang等用试管苗刚长出来的第一片真叶诱导出了沙田柚的体细胞愈伤组织，并再生植株[3]。【本研究切入点】本研究在以沙田柚为母本，异源四倍体体细胞杂种为父本的杂交和胚挽救过程中，发现从沙田柚杂种幼胚中长出了胚性愈伤组织。这个结果提示沙田柚受自身基因型的限制，很难从幼胚直接获得胚性愈伤组织，如果与其它容易获得胚性愈伤组织的品种杂交，改变其遗传组成，可以较为容易地获得沙田柚杂种的愈伤组织，这些愈伤组织中也包含了沙田柚的基因，这为沙田柚种质资源的保存和利用提供了新的途径。【拟解决的关键问题】异源四倍体体细胞杂种与沙田柚杂交产生的三倍体幼胚在发育过程中容易败育，因此，在胚败育之前，对幼胚进行胚抢救是诱导成功的关键因素。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2002年3月，以沙田柚（Citrus grandis [L.] Osbeck cv. Shatian）为母本，用体细胞杂种橘柚+无酸甜橙（[C. reticulata Blanco × C.paradisi Macf.] cv. Nova + C. sinensis [L.] Osbeck cv. Succari）的花粉进行授粉，体细胞杂种的花粉来自美国佛罗里达大学柑橘研究与教育中心，由Grosser博士惠赠。 1.2 试验方法

1.2.1 胚抢救 为进行柑橘胚挽救，在授粉后90 d左右，将幼果采回，于4℃下暂时保存。在超净工作台上将果实表面用5%（v/v）的NaClO（含有效氯成分10%）消毒20 min后剥开果实，取出未成熟种子，将种皮剥掉，取幼胚置于MT[4] + ME（麦芽提取物，500 mg·L-1）和MT + GA3（1 mg·L-1）两种固体培养基上培养。在幼胚培养的过程中发现愈伤组织后，将部分愈伤组织挑出来，在不加任何激素的MT基本培养基上继代保存。

1.2.2 愈伤组织的倍性检测 以二倍体愈伤组织作对照，用细胞流式仪（PAⅠ，德国Partec公司生产）检测倍性。具体方法为：取少许愈伤组织于55 mm的小塑料皿里；加入400 µl提取缓冲液HR-A；用刀片将愈伤组织切碎，30 s后通过20～50 µm的微孔滤膜将样品过滤到2.5 ml小试管里；加入1.6 ml DNA染色液HR-B，染色30～60 s；上样检测。

1.2.3 DNA提取 取4～5 g愈伤组织和沙田柚的叶片，用液氮研磨后提取DNA。DNA的提取参考程运江等的方法[5]，父本体细胞杂种的DNA由美国提供。 1.2.4 SSR标记检测 用2对SSR引物TAA27和TAA1对愈伤组织的亲本来源进行了检测，TAA27引物对序列为TAA27a：5´-GGATGAAAAATGCTCAA AATG-3´，TAA27b：5´-TAGTACCCACAGGGAAGAG AGC-3´；

TAA1引物对序列为TAA1a：5´-GACAACATC AACAACAGCAAGAGC-3´，TAA1b：5´-AAGAAGA AGAGCCCCCATTAGC-3´，两对引物均由上海博亚生物技术有限公司合成。SSR 20 µl扩增体系里包括80 ng模板DNA，1×反应缓冲液，200 µmol·L-1 dNTP，1.5 mmol·L-1 MgCl2，

1 U Taq酶（Promega公司生产），0.1 µmol·L-1正向引物，0.1 µmol·L-1反向引物，灭菌的超纯水。在PTC-200 PCR仪（MJ. Research Inc.，USA）中进行扩增反应。具体步骤为：94℃变性5 min；紧跟着30个循环：94℃，1 min，55℃，30 s，72℃，1 min；最后72℃，5 min，4℃保存。扩增产物先在1%琼脂糖胶上检测扩增效果，扩增出来后，再在6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，具体操作参考庞晓明等[6]的方法。 1.2.5 愈伤组织胚性再生能力鉴定 分别称取0.5 g 左右的愈伤组织，接种在MT+ME（麦芽提取物，500 mg·L-1）, MT+乳糖（50 g·L-1），MT+甘油（2%）3种培养基上。每种培养基设3次重复，40 d后在体视显微镜下观察每个重复产生的胚状体个数。每个重复计数5次，取平均值，即为每个重复中的胚状体数目。愈伤组织的胚性再生能力=每个重复产生的胚状体数目/愈伤组织质量，即每克愈伤组织产生的胚状体个数。

2 结果与分析

幼胚培养约5个月左右，在两种培养基上都有少量幼胚长出了胚性愈伤组织（表1）。在MT+GA3（1 mg·L-1）培养基上培养的258个幼胚中，有24（9.3%）个产生了胚性愈伤组织，在MT+ME（500 mg·L-1）培