生物分析化学作业(6)

结果显示所有的蛋白质都会受基质影响：人α-La和牛α-La显示相似SSE程度（牛α-La，97.1%；人α-La，98.2%），而牛β-Lg A和β-Lg B的信号强大都被显著增强了（β-Lg A,245.4%;β-Lg B, 254.1%）。这可能是因为β-Lg与α-La的蛋白质序列、稳定性和CSDs完全不同，所有被基质影响的程度也不同。为了确保定量的可靠性，测试中IS和基质校正同时被引入：IS用来校正样品制备中的回收率损失，而基质校正被用来消除离子化效应。

3.4 定量分析的扫描模式选择

在以前的研究中，一些采用全扫描模式LC–ESI-MS法被发展用来分析初始和单/二形式的α-La和β-Lg。当婴儿奶粉中的乳清蛋白浓度相当低时，这些方法的灵敏度是个问题。为了提高灵敏度，作者在测试张采用了基于选区监测模式的定量方法。三个在质谱标准中相对丰富的质量范围被选作集中区域。这些集中区域被用来分析每种分析物。以牛α-La为例，其初始和解卷积质谱如图3所示，5+ (m/z, 2836.6), 6+ (m/z, 2364.1) and 7+ (m/z, 2026.5)峰由于较高的强度被选来作定量分析。备选扫描区域为2020–2030 (m/z) 目标 7+ 荷电态， 2357–2367 (m/z) 目标 6+ 荷电态，2830–2840 (m/z) 目标为 5+ 荷电态。然后，利用四个校正曲线计算三个婴儿奶粉样品的牛α-La含量，四个曲线分别为2020–2030 (m/z),

2357–2367 (m/z), 2830–2840 (m/z) 和800–3200 (m/z, 全扫描)。结果显示选区检测模式下计算出来的牛α-La含量几乎与全扫描模式下计算出的含量一样，说明两种模式都可以用来定量分析三种乳清蛋白。于是便得到了灵敏的分析方法。最低检测限在2357–2367 (m/z)区域内得到。因此，选择2357–2367 (m/z)作为牛α-La作为检察范围。通过这个方法，β-Lg A 和β-Lg B的检测范围被分为确定为1665–1675 (m/z) 和1656–1666 (m/z)。我们可以下结论说，我们选择了初始质谱中从初始点和结束点都是为最高峰的区域作为相关乳清蛋白的扫描分析区域。据此，人α-La的扫描范围是2339–2349 (m/z)。相对于全扫描模式，选区检测模式的利用大大提高了此法的灵敏度（至少在有三次是最高的），RSDs在1.99–4.36%，表明此法具有理想的灵敏度和重现性。基于以上论述，建立选区检测模式的质谱分析方法适于用来分析婴儿奶粉中的牛α-La，β-Lg A和β-Lg B。

3.5 分析性能

为了使同时检测婴儿奶粉中牛α-La，β-Lg A和β-Lg B的UHPLC–MS法有效，此分析法的线性，灵敏度，回收率，精确度和重现性等分析性能必须理想。

3.5.1 线性和灵敏度

在空白基质中制备包含50μgmL 1的人α-La (IS) 每个蛋白质标准溶液，浓度分别为0.4, 1, 2, 4, 10, 20, 40, 60μgmL 1。注入(1μL)每个标准溶液后，

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