生物分析化学作业(2)

蛋白质的强大工具。尽管此种分析法在纯溶液和基质中的的离子化效率差异会影响其精确度。这个问题可以通过以下两种途径解决：一、采用外部基质校正；二、在样品中加入内标来校正制样和离子化效应所产生的复苏性损失。

用LC-MS定量蛋白质可以再核苷酸水平（经过蛋白质消化后的信号核苷酸分析）或蛋白质水平（未经接触的蛋白质分析）。描述了利用同位素标记合成类似物作为IS通过分析胰蛋白酶信号核苷酸进行蛋白质定量的方法。这种方法的优势是：检测限低和同位素标记核苷酸易于获得。缺点是IS的表现也许会和在消化前过程中的未经接触的蛋白质很不相同。这会导致分析和IS的不同损失，并接着影响方法的精确度。蛋白质水平分析直接进行分析，避免了潜在的会产生问题的消化步骤，但是合适的IS得获得是是一个主要问题。理论上，理想的IS是同位素标记的所分析蛋白质的类似物，它在整个样品制备过程中的表现和被分析蛋白质相似。然而获得这样的IS需要复杂的制备过程。替代方法是采用与所分析蛋白质序列相似的物种变体（例如，不同物种的同一蛋白质）作为IS。此方法采用山羊β-Lg和麋羚β-Lg作为检察奶制品中牛β-Lg的IS。

采用LC-MS在生物基体中定量分析蛋白质的关键问题是不同婴儿奶粉中的乳清蛋白含量显著不同所产生的灵敏度问题。在以前的研究中，研究者采用完全扫描模式下的质量分析来获得蛋白质的完全电荷分布（CDs）。这种方法可以避免潜在的精确度或重现性问题。但是，灵敏度达不到同时检测不同婴儿奶粉中主要乳清蛋白质的要求。

基于这些考虑，作者在实验室中发展了一种可靠的UHPLC-MS联用的方法用来同时检测婴儿奶粉中牛的α-乳白蛋白和β-球蛋白。这种方法检测时间短、灵敏度良好、扫描模式可靠、IS合适以及结构鉴定选择性合适。作者还展示并评价了可靠性的细节参数，如线性、恢复性、灵敏度、精确度和重现性。文章中还应用此法检测了不同婴儿奶粉中三种乳清蛋白的分布。

2、实验部分

2.1 化学药品（材料和试剂）

乳清蛋白：牛α-Lg（纯度≥90）和β-Lg(A和 B 纯度≥90) 人乳中分离的人α-Lg

纯化水、 HPLC级乙腈和甲醇、醋酸、甲酸、三氟醋酸（TFA）、其他溶剂为分析纯、高品质PDEF注射过滤器（孔径0.22μm，直径13mm）。

2.2 仪器

超高液相色谱仪

超高液相色谱BEH300 C18色谱柱（150mm×2.1mm,1.7μm）

流动相速率0.25ml/min

流动相包含0.1%三氟醋酸(TFA)水溶液（A）和0.1%三氟醋酸（TFA）的乙腈（B），线性梯度洗脱过程如下（所有值都是体积比% v/v）:初始39%B，在2min内从39%线性上升到42%；在2.3 min内从42%线性上升到44%;在0.2min内从44%线性上升到100%;100% B等度洗脱0.5min；在0.5min内色谱柱移动相恢复到初始成分；2.5min内色谱柱恢复到初始（总持续时间：8min）。注入体积1μL。 质谱仪采用正电模式电喷雾源。离子化器条件如下：管压3.5kv；进样锥电压，45v；源温度，120℃；脱溶剂气温度，350℃；锥孔反吹气流，55Lh-1;去溶剂化气流，580 Lh-1。定量分析在800-3200（m/z）全扫描模式下进行。采用Max-ENT