周厚庆等: Raf-1激酶与肿瘤治疗1163

(A)

Raf-1

the structure of Raf-1 protein

61

56

131139184RBD

CRD

194254

CR2

338341N-region

269

335

CR3355363497

563

ATP-Activation

bindingsegmentdomain

627

(B)

the structure and phosphorylation residues of Raf-1 protein

PAK1, PAK3,Growth factor

KSR, MEK

T268CR2

CR3

S338

PKCα

S499

S43PKA

Akt, PKA

S259Y431S621

Scr

14-3-3

图1 Raf-1蛋白的结构以及磷酸化调控位点

Fig.1 Structure and phosphorylation sites of Raf-1 protein

后具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性。其中Raf-1由648个氨基酸组成, 分子量约为74 kDa, 是目前为止研究最广泛、最深入的亚型。Raf激酶家族结构类似, 其分子结构都包含3个保守区域(conservative region, CR)(图1)。CR1包含Ras结合域(Ras-binding domain, RBD)和半胱氨酸富集域 (cysteine-rich domain, CRD)。CR2含有重要的磷酸化位点, 它参与了Ras结合以及Raf激活的负调控[6]。CR3为激酶结构域, 包含激活区域, 对于激酶激活起着关键作用[7]。随着近年来分子生物学的发展, RBD的结构域、Raf-1的CR1拓展结构域[8-10]以及B-Raf [11]和Raf-1[12]的CR3结构域的功能已经被成功鉴定。这为以Raf为靶点的肿瘤治疗奠定了理论基础。

2 Raf-1与肿瘤发生

2.1 Raf-1对细胞凋亡的调节

2.1.1 对线粒体途径的调控 Raf-1可以通过线粒体途径来发挥抑制细胞凋亡的作用[14-16]。 当凋亡抑制蛋白Bcl-2过表达时, Raf-1被Bcl-2激活并将抑制细胞凋亡信号传递至线粒体[17]。此外, 部分生长

因子和p21活化激酶(P21-activated kinases, PAK)共同参与了Raf-1激酶的S338位点的磷酸化[18-19], 进而促进Raf-1转位至线粒体。 Raf-1介导了Bcl-2家族成员促凋亡蛋白BAD的磷酸化失活[17]。此外, Raf-1作为支架蛋白来募集蛋白激酶C-θ(PKC-θ), 进而诱导BAD磷酸化[20]。Raf-1与线粒体的电压依赖性阴离子通道(voltage dependent anion channels, VDACs)直接相互作用, 可能抑制了细胞色素C从线粒体向胞浆的释放[21]。且与Raf激酶抑制蛋白RKIP分离的Raf-1转位至线粒体, 抑制了细胞凋亡, 最终促进癌症发生[22-23](图2)。

2.1.2 对Fas激酶的调控 Fas是肿瘤坏死因子受体家族成员, 广泛存在于组织细胞。研究显示, Rock2激酶活性增高可促进细胞骨架连接蛋白(ezrin)发生磷酸化而激活, 进而促进Fas在Raf-1敲除的胚胎成纤维细胞的细胞膜上募集和表达, 最终促进细胞凋亡[24-25]。Fas活化可促进Raf-1-Rock2络合物的形成, 下调Rock2激酶的活性。因此, Raf-1通过与Rock2直

1.2 Raf-1的调控

Raf-1的调控是以激活/去激活循环的方式进行的。在Raf-1处于非激活状态时, Raf-1以封闭环的形式存在。封闭环是N端调控区域折叠封闭了催化区域而形成[13]。当激素、生长因子等与细胞表面受体

结合时, 细胞中的Ras-GTP增加, 进而激活Ras; Ras的激活会引发Ras-GTP与Raf-1直接结合, 从而将细胞浆中的Raf-1二聚体募集到细胞膜上。募集到膜上的Raf-1发生磷酸化而激活。最终, 激活的Raf-1与蛋白磷酸化酶PP5特异性结合从而使得Raf-1发生去磷酸化, 导致Raf-1回到非激活状态。