乳制品中产细菌素乳酸菌的筛选(2)

2.4.抗真菌扩散法

乳酸菌抗真菌活性检测采用抗真菌扩散法。将乳酸菌接种于两个2厘米线的MRS培养基上，并在30℃下培养。软麦芽提取物琼脂（7％）10毫升，含有1毫升接种的霉菌和（或）酵母提取琼脂，然后浇到琼脂平板上，并在30℃培养，48小时后，测量抑菌圈。抑菌程度由抑制增长面积与培养皿的总面积的关系来计算，规则如下：—=无可见抑制；（+）=弱的抑制作用，细菌在软琼脂上生长；+=3％（板面积/细菌）没有真菌生长；++=3-8％（板面积/细菌）无霉菌生长；+++=8％（板面积/细菌）无真菌生长。

2.5.兼性和专性异型发酵乳酸菌的特征

2.5.1.表型标准的表征

兼性异型发酵乳酸菌，革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，应用于纤维二糖，葡萄糖，甘露醇，蜜二糖，甘露糖，棉籽糖，鼠李糖和核糖生产酸测试。专性异型发酵的乳酸菌被用于以下测试：阿拉伯糖，纤维二糖，半乳糖，甘露醇，甘露糖，蜜二糖，松三糖，棉籽糖，鼠李糖，核糖，蔗糖，木糖产酸测试。碳水化合物发酵则使用无菌多孔板和API确定。

2.5.2.全细胞蛋白质凝胶电泳（SDS-PAGE）的表征

全细胞蛋白SDS-PAGE电泳被用来作为一个额外的分类工具，用来区分兼性和专性的异型发酵乳酸菌的表征。全细胞蛋白分析由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行描述。破碎细胞中蛋白质含量的测定按洛瑞， Rosebrough ，法尔，和Randall （1951）和适当的数量的SDS-PAGE按照Laemmli等（1970年）来做。蛋白质电泳图谱的登记，正常化测量密度的痕迹，菌株分组皮尔逊积差相关系数（R）和UPGMA（非加权配对组使用的算术平均数的方法）

分离菌株通过比较其参考菌株蛋白质图谱特征的模式进行鉴定。参考株如下，副干酪（LMG 11459），Lac-tobacillus paraplantarum（LMG 16673 比利时根特大学微生物学实验室BCCM/ LMG收集菌），植物乳酸杆菌（ATCC 14917，ATCC，美国典型菌种保藏中心，洛克维尔，马里兰），戊糖乳酸菌（NCFB363; NCFB，国家食品细菌的收集，AFRC，土特食品研究机构，Reading，英格兰），鼠李糖乳杆菌(NCFB 7469)，短乳杆菌(DSM 2647)， 布氏乳杆菌(DSM 5987), 溶胶乳杆菌(DSM 20515)和发酵乳杆菌(DSM 20052，DSMZ, 德国微生物收藏和德国不伦瑞克细胞培养有限责任公司）

2.6 抗菌活性测定抑菌谱

兼性和专性异型发酵乳酸菌菌株在30℃培养16小时活化，用Kekessy 和Piquet (1970)的方法（可检测乳酸菌细菌素的生产）测定抑菌活性。指示菌用相应的液体培养基培养，直到600 nm的光密度值为0.45。乳酸菌在MRS琼脂平板表面上的接种点接种。培养（48小时，37℃）后用无菌小铲从培养皿边缘将琼脂分离，倒在皿盖上，然后覆盖在接有指示菌（稀释1％）的软琼脂上。培养，只要形成抑菌的区域，即进行测量。食源性致病菌用于测试的菌株的抗菌活性，如下：大肠杆菌0：44 NCTC 9702（NCTC，国家标准菌库，AFRC，英格兰），金黄色葡萄球菌NCTC 9751，小肠结肠炎耶尔森氏菌0:9/4360（巴黎巴斯德研究所提供），单增李斯特菌Scott A和一株蜡状芽孢杆菌（由萨洛尼卡亚里士多德大学医学院提供）。

2.7.抑菌物质对PH、蛋白酶、过氧化氢酶的敏感性

八株兼性异型发酵菌株利用扩散法（罗伊，Batish，格罗弗和Neelakantan ，1996年）进行实验，其抗真菌和抗菌活性一个有趣的趋势，优先抑制李斯特菌、Scott A和其他食源性致病菌。细菌发酵液提取物由MRS肉汤培养后离心获得的菌株（12000g，10分钟，4℃，3K20型西格玛离心机离心）。此外，抗菌物质（AMS）样品被5N的氢氧化钠中和以排除有