基因工程思考题答案--删减后(5)

基因工程通宵版

6、为什么通过碱性磷酸酶处理可以防止质粒载体DNA自连的作用？

答：碱性磷酸酶可催化除去DNA、RNA的5′磷酸基团。碱性磷酸酶处理过的DNA片段缺少连接酶所要求的5′磷酸末端，因此它们不能进行自我连接。在质粒载体与外源DNA连接构建重组质粒时，使用碱性磷酸酶处理酶切过的质粒，可以降低载体DNA的自连。

第五章

1. 以pBR322为例，论述质粒载体必须具备哪些条件？

（1） 具有复制起点，在宿主细胞中能自主复制。

（2） 带有尽可能多的单一限制性酶切位点，以供外源DNA片段定点插入。

（3） 具有合适的选择标记基因，为宿主细胞提供易于检测的表型特征。

（4） 具有较小的分子量和较高的拷贝数。

2. 试述λ噬菌体载体是如何进行构建的？

（1） 去除λDNA非必需区，增加承载外源DNA片段的容量。

（2） 去除多余的限制酶切割位点，确定1～2个单酶切位点作为克隆位点。

（3） λDNA的非必需区组入选择标记基因，以方便对重组子进行筛选。

（4） 建立重组的λDNA分子的体外包装系统，高效的感染受体细胞。

5. 简述表达载体需要哪些基本元件？各有什么作用？

在克隆载体的基础上，表达载体的构成特别强调与表达强弱相关的构成元件如启动子、终止子、核糖体结合位点等。

（1）启动子：启动子位于转录起始点上游，是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，是启动基因转录所必需的一段DNA顺式调控元件。没有启动子，基因就不能转录。

（2）终止子：在一个基因的3′端或是一个操纵子的3′端往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为转录终止子（terminator）。在构建表达载体时，为了防止由于克隆的外源基因的表达干扰了载体系统的稳定性，一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的核糖体RNA的转录终止子。

（3）核糖体结合位点：核糖体（rRNA）是蛋白质合成的场所，mRNA有效地翻译依赖于mRNA的稳定性及其与核糖体结合的能力。

6.论述双元载体的概念及构建原理。

双元表达载体由2个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成，即微型Ti质粒（min-Ti plasmid）和辅助Ti质粒（helper Ti plasmid）。

利用二元载体进行遗传转化时，首先要将外源基因构建到微型Ti质粒上，再将微型Ti质粒转入含有辅助Ti质粒的土壤农癌杆菌菌株中，用该菌株侵染植物组织，含目的基因的T-DNA可整合到植物基因组中。双元载体不仅构建方便，而且其T-DNA整合进入植物细胞不需要带进许多冗余DNA序列，转化效率高于一元载体。

第六章

1、克隆基因的方式有哪些？

目前基因克隆的手段多种多样，概括起来主要包括两种策略：一种是构建大容量或者经特定手段优化的基因文库，然后利用一定的筛选方法从中分离、鉴定出需要进行研究的目的基因；另外一种策略是在基因序列已知的基础上，通过PCR扩增、改造或者人工化学合成的方法获得目的基因。目前几种常见的基因克隆手段，如基因组DNA文库、cDNA 文库、PCR扩增法、人工化学合成法、差异克隆技术等。

2、试述基因组文库的构建流程及其影响因素。