基因工程思考题答案--删减后(8)

基因工程通宵版

化。

⑥ 亲和层析：是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗原与抗体、受体与激素、酶与底物或抑制剂、操纵基因与阻遏蛋白、凝集素与糖类以及核酸与有关蛋白之间的结合。

⑦ 电泳：蛋白质电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。PAGE可分为Native-PAGE和SDS-PAGE两种，前者主要用于不能变性的表达蛋白的分离与纯化，后者则用于可通过变性的方法作进一步纯化的特异性表达蛋白。该电泳纯的样品可用来进行氨基酸序列分析、免疫学分析和医学研究等。

5. 重组质粒发生逃逸的原因有哪些？

① 重组质粒在细胞分裂时不均匀分配，造成受体菌种所含的重组质粒拷贝数存在差异； ② 来自受体细胞的遗传影响；

③ 重组质粒所携带的外源基因过度表达，抑制了受体细胞的正常生长，以致原来体系

中数目极少的不含重组质粒的菌体经过若干代繁殖后在数量上占据优势；

④ 重组质粒因种种原因被受体细胞分泌运输至胞外，这种情况多发生在细菌处于高温或

含表面活性剂（如SDS）、某些药物(如利福平）以及染料（如吖啶类）的环境中。

第八章

1 对作为表达目标蛋白宿主的酵母细胞有什么基本要求？

答：对作为表达目标蛋白宿主的酵母细胞的基本要求是

①安全无毒，没有致病性。②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。④培养条件简单，容易进行高密度发酵。⑤有较强的蛋白质分泌能力。⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能力。

2 什么叫穿梭载体？指出酵母穿梭表达载体pYES2每个元件的功能。

答：穿梭表达载体是由来自酵母的部分核酸序列和细菌的部分核酸序列所组成，其原核部分主要包括可以在大肠杆菌中复制的起点序列(Ori)和特定的抗生素抗性基因序列，这两个部分主要是作为在大肠杆菌宿主时增殖和筛选组分。酵母部分包括酵母转化子的筛选组分，主要是与宿主互补的营养缺陷型基因序列(如：HIS4基因序列)或特定的抗生素抗性基因序列(如：抗Zeoein的基因序列)，以及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。

pYES2每个元件的功能:

2μori: 酵母细胞复制起点，URA3：酵母细胞尿嘧啶营养筛选标记；Amp：氨苄青霉素抗性筛选标记；PUC ori: 大肠杆菌复制起点；CYCTT：CYC基因加尾信号；Pgal1 ：gal基因启动子；f1 ori: f1噬菌体复制起点。

3 提高外源基因在酵母中的表达水平，考虑从哪些方面入手？

答：为提高外源基因在酵母中的表达水平，可以考虑从以下方面入手：

一、转录水平控制

外源基因在酵母中的表达和基因的转录水平有密切的关系，筛选高效的启动子就显得十分重要，强启动子还可以表达多种基因。

二、表达载体的拷贝数和稳定性

表达载体在细胞中的拷贝数对外源基因在酵母中的表达有明显的影响。酿酒酵母和其他一些酵母有多拷贝的内源质粒，以这类质粒为基础可以建成高拷贝质粒表达载体。