基因工程思考题答案--删减后(4)

基因工程通宵版

DNA聚合酶活性和dNTP分子造成损害。②变性后的DNA迅速冷却至40~60℃，可使引物和模板DNA发生结合。③复性温度的选择，可以根据引物的长度及其G＋C含量确定。长度在15~25bp之间时，引物的退火温度可通过Tm=4（G＋C）＋2（A＋T）计算得到。④PCR反应的延伸温度建议选择的70~75℃之间，此时，Taq DNA聚合酶具有最高活性。当引物在16个核苷酸以下时，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。此时，可采用使反应温度缓慢升高到70~75℃的方法。⑤PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1kb以内的片段，延伸时间1分钟即可；扩增片段在1kb以上则需加长延伸时间。⑥其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上20~25次循环之后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。

10.解释以下名词：反向PCR，不对称PCR，反转录PCR，多重PCR

反向PCR: 用于扩增位于靶DNA区段之外的两侧的未知DNA序列。

不对称PCR：可用于制备单链模板DNA。这种方法除了使用的两种引物浓度相差100

倍之外，其它方面与标准的PCR并没有本质的区别。

反转录PCR：用于扩增被反转录成cDNA形式的特定RNA序列。

多重PCR技术：即在同一试管中加入多对引物，扩增同一模板的几个区域。

12.简述核酸杂交的基本过程，核酸印迹转膜有哪些方法?

核酸杂交的基本过程：将核酸从细胞中分离纯化后，在体外与探针杂交，或直接在细胞内进行杂交的过程。

核酸印迹转膜有：Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、斑点杂交及狭缝印迹杂交。

第四章

1、什么是DNA限制性内切酶；基因工程中常用的是哪种类型，如何命名？

答：DNA限制性内切酶：是能识别并切割双链DNA序列内部特定核苷酸序列的DNA水解酶。它可以将外源DNA切断，从而限制外源DNA的侵入并使之失去活力，但对自身的 DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。

基因工程中常用的是II型限制性内切酶。人们使用限制性内切酶寄主菌的种属名称，来命名限制性内切酶，即以微生物属名第1字母（大写）和种名前两字母（小写）写成斜体三字母，例如，大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示。菌株名以非斜体在此三字母后，若菌株有几种不同限制性内切酶时，则以罗马字母区分，如HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ等等。

4、利用逆转录酶和mRNA模板合成cDNA的主要步骤是什么？

答：（１）以具有poly（A）结构的mRNA做模板，并以12—18个碱基长的多聚胸腺嘧啶寡核苷酸oligo（dT）片段作引物，在逆转录酶的5′-3′聚合酶活性催化下，合成出与模版mRNA的单链互补的cDNA单链。具有poly（A）结构的mRNA是采用一定的抽提方法从生物体内分离纯化而来，在mRNA单链的3′端是由一连串碱基A组成的多腺嘌呤尾巴。胸腺嘧啶可以与腺嘌呤配对互补，所以采用oligo（dT）做引物，与mRNA3′端的poly

（A）尾巴结合。（2）碱水解法除去mRNA模板之后，单链cDNA能够自我折叠形成发夹环结构，折叠的短链即成为第二条cDNA链合成的引物，反转录酶或Klenow酶就可催化第二条链cDNA合成。（3）采用SI核酸酶消化法，除去单链区的发夹环结构，就可将获得完整的DNA分子。