基因工程思考题答案--删减后(6)

基因工程通宵版

构建流程

一般来说，构建基因组文库的基本步骤有五步：①高分子量DNA的制备；②外源DNA片段与载体分子的重组；③重组载体转化受体细胞；④阳性克隆的挑选；⑤基因组文库的评价和鉴定。

影响因素

（1）载体的种类与质量;（2）高分子量的染色体DNA的获得 ;（3）避免DNA的降解;（4）选用的限制性核酸内切酶对基因组DNA的切割频率及酶切反应条件。;（5）插入DNA片段的大小;（6）插入DNA片段与载体的比例;（7）DNA的总浓度;（8）连接的温度

3、用于扩增基因的PCR方法有哪些？各有什么特点？

（1）RT-PCR法，是一种从细胞mRNA中高效扩增cDNA序列的方法，它将反转录与PCR扩增技术相结合。

（2）反向PCR，用于扩增已知目的基因序列侧翼的DNA片段，即根据已知的目的基因DNA序列设计引物，以已知序列和未知序列的环化DNA分子为模板来扩增未知DNA序列。

（3）锚定PCR，是一种根据已知目的基因的一小段序列信息来快速扩增已知序列上游或下游片段的技术。

（4）连接介导的PCR，在只知道DNA一端的序列的情况下，能够对未知的一端序列进行测序和对体内甲基化图谱或DNA印迹进行分析。

（5）盒式PCR，盒式PCR可特异性地扩增cDNA或基因组DNA上的未知区域。

（6）RACE，是一种通过反转录和PCR技术进行cDNA末端快速扩增，得到基因转录本的未知序列，从而获得mRNA完整序列的一种方法。

4、什么是cDNA文库？它的基本构建流程是怎样的？

以mRNA为模板，在体外经逆转录酶催化反转录成cDNA，与适当载体连接后转化受体菌并繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。

基本构建流程:

一般来说，构建cDNA文库的基本步骤有五步：①制备mRNA；②第一链cDNA合成；③第二链cDNA的合成；④双链cDNA的修饰及克隆；⑤对构建的cDNA文库进行鉴定，测定文库的代表性以及重组cDNA片段的序列完整性。

7、人工合成长片段基因的方法有哪些？

长片段基因的合成，通常的策略是将需要合成的基因分成若干个相互重叠的片段，先利用化学合成法分别合成这些小片段，然后让这些片段退火配对，最后利用连接酶和聚合酶将这些片段连接成完整的基因序列。包括退火-连接法、多步退火-延伸-连接法和由内向外多步退火-延伸合成法。

12、转化后对重组子进行筛选的方法有哪些？

重组子的筛选方法多种多样，是由载体的类型、插入DNA片段大小和性质，以及受体细胞的遗传特性等的不同决定的。主要包括两类：一、依据载体的选择性标记对转化子进行初步筛选，包括抗药性筛选法、显色筛选法、营养缺陷型筛选法和噬菌斑筛选法。二、菌落原位杂交法

14、对DNA进行定点突变的方法有哪些？

DNA定点突变的方法分为两大类。

第一类是基于PCR的点突变，包括重叠延伸PCR 法、大引物PCR 法、特殊位置碱基