基因工程思考题答案--删减后(7)

基因工程通宵版

的定点突变和扩增环状质粒全长的突变。

第二类是不依赖于PCR的定点诱变方法，包括盒式诱变、寡核苷酸介导的诱变和Kunkel法

第七章

1. 什么是RBS？RBS在基因表达中有何作用？

RBS，即核糖体结合位点，是指紧靠启动子下游的，从转录起始位点开始延伸几十个碱基长度的一段序列，翻译起始密码子AUG通常位于它的中心位置，是核糖体RNA识别与结合的位点。

作用：SD序列是翻译起始密码子（AUG）上游5-13个核苷酸处的一段富含嘌呤UAAGGAGGU的全部或者其中的一部分序列，在翻译起始阶段与核糖体小亚基16S rRNA的3’端相互作用，以正确定位起始密码子。

2. 外源基因在原核生物中表达时，蛋白质的存在形式有哪些？各有什么优缺点？

① 包涵体表达：优点：包涵体的形成有利于防止宿主蛋白酶对表达蛋白的降解。缺点：

包涵体形成后，表达蛋白不具有生物活性，因此必须溶解包涵体并对表达蛋白进行复性；另外，由于表达产物形成包涵体，负责水解起始密码子编码的甲硫氨酸的水解酶，不能对所有的表达蛋白质都起作用，这样就可能产生N-末端带有甲硫氨酸的目的蛋白质的衍生物，而非生物体内的天然蛋白，这可能会对某些蛋白质的性质产生影响。

② 分泌型表达： 优点：简化了发酵后处理的纯化工艺；减少了外源蛋白在细胞内被蛋白酶降解的几率；通过对分泌表达的设计有利于形成正确的空间构象，获得有较好生物学活性或免疫原性的蛋白质。

③ 融合型表达：优点：能以较高的效率进行，因为受体菌自身蛋白基因的SD序列和碱基组成等有利于基因的表达。外源蛋白以融合蛋白的方式表达时易于分离分离纯化，可根据受体菌蛋白的结构和功能特点，利用受体菌蛋白的特异性抗体、配体或底物亲和层析等技术分离纯化融合蛋白，然后通过蛋白酶水解或化学法特异性裂解受体菌蛋白与外源蛋白之间的肽键，获得纯化的外源蛋白产物。

3. 分离纯化基因工程菌的表达产物策略的制定要考虑哪些因素？

①表达系统的影响；②表达产物性质的影响；③初始物料、杂质等因素的影响；④生产工艺、生产条件的影响。

4. 分离纯化基因表达产物的过程一般包括哪些步骤？各有哪些细节需要注意？

一般都包括对发酵液进行预处理、回收菌体、细胞破碎、离心分离、样品的浓缩与预处理、柱层析和电泳等步骤。

① 发酵液的预处理：主要包括改变发酵液物理性状（如加热、调节pH值、絮凝等）

以及改善固液分离特性（通过过滤等方法实现固液分离）两类方法，根据被分离物质的性质可选择某一种或者其中的几种方法相结合使用。

② 细胞分离：通过原核细胞培养获得的培养液，无论目标蛋白位于细胞内还是被分泌到细胞外的培养基中，首先都应该将细胞与培养液进行分离，一般通过离心沉降或者过滤的方式进行分离。

③ 细胞破碎：对于在胞内表达的蛋白质，将细胞与液态相分离后，就要考虑将细胞破碎，以使目标蛋白质从胞内释放到提取液中，然后进行目的产物的纯化。

④ 离心分离：高速离心的离心力一般在10000g的范围以内，主要用来去除未破碎的细胞和细胞壁碎片等。如果基因表达产物是小分子可溶性蛋白，还可以进行超速离心（100000g以上）以除去细胞膜碎片等杂质。

⑤ 柱层析：根据蛋白质的不同用途，需要对表达的特异性蛋白质进行进一步的分离纯