酵母表达系统概述及相关研究进展(2)

酵母双杂交系统

基因工程与酵母表达系统

即使酵母表达系统具有一些优势，但在用于生产蛋白质等药物时，还需要选择合适的载体并对宿主菌的某些代谢途径进行改造，使之利于目标产物的表达，要用于工业生产，还需根据实际情况优化培养条件，比如pH，温度，溶氧量，培养基营养，特殊添加剂等。

酿酒酵母的表达载体有自主复制型和整合型，自主复制型质粒通常有30个或更多的拷贝，含有自动复制序列(automaticreplicating sequence，ARS)，能够独立于酵母染色体外进行复制 ，如果没有选择压力，这些质粒往往不稳定。整合型质粒不含ARS，必需整合到染色体上，随染色体复制而复制。整合过程是高特异性的，但是拷贝数很低。为此，人们设计了pMIRY2(for multiple integration into ribosomal DNin yeast)质粒，旨在将目的基因靶向整合到rDNA簇上(rDNA簇为酵母基因组中串联存在的150个重复序列)，因此利用pMIRY2质粒可以得到100个以上的拷贝。值得注意的是，酿酒酵母表达的外源蛋白质往往被高度糖基化，糖链上可以带有40个以上的甘露糖残基，糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅1,3甘露糖，致使产物的抗原性明显增强。

毕赤酵母的表达载体多采用整合型载体，即将异源基因通过载体整合进酵母基因组中，这是由于没有适合毕赤酵母的游离型表达载体。所有巴斯德氏毕赤酵母的表达载体都是一个表达组件，它由一个启动子序列（大多是AOX1启动子），一个来自AOX1的转录终止序列用以指导3’终止过程和mRNA的多聚腺苷酸化，在它们之间有一个或多个克隆位点用以插入外源基因。这样的设计保证了产物(cap-AOX1 5′UTR-ORF-3′UTR-polyA)是一个成熟的mRNA以适应毕赤酵母的细胞体系，确保了信息的稳定性和有效性。检测表达所用的标记基因一般是HIS4（组氨醇脱氢酶基因），有时也用kan （卡那霉素抗性基因）或Sh ble. 此外，有时为了防止酵母自身蛋白酶对所要表达的异源蛋白的降解，会使用蛋白酶缺陷突变型或降低发酵温度，保证目的蛋白的产量和得率。发酵过程一般分两个阶段，第一阶段是细胞以甘油为碳源生长，甘油耗尽后进入第二阶段，加入甲醇诱导AOX1启动子的转录翻译，从而使异源基因表达，生产目标蛋白。

酵母表达系统研究进展

1． 利用酿酒酵母生产青蒿素前体——青蒿酸

青蒿素（Artemisinin）是目前治疗疟疾的高效药物，这主要是由于疟原虫（Plasmodium falciparum）逐渐对其它药物产生了抗药性。现在青蒿素的产量远达不到需求量，所以Jay D. Keasling 等人通过酿酒酵母生产它的前体——artemisinic acid，成本低，环保，可作为高质[2]R