酵母表达系统概述及相关研究进展(4)

酵母双杂交系统

母特异性糖酰化基因的敲除和14个异源基因的导入。利用SDS-PAGE和HPLC提纯分离的重组EPO具有与剂量相关的生物学活性。EPO是一种高度糖基化的蛋白质，利用酵母表达需要在N-乙酰葡糖胺或甘露糖等修饰后再加上人源的唾液酸化过程，才能产生有活性的EPO（已经进行动物试验）。这项研究表明利用酵母生产EPO等同类糖蛋白具有可行性，不仅能节省时间，而且节约成本，大量生产以缓解对这类医疗药物的需求。

酵母表达的糖蛋白不同于哺乳动物表达的杂合型或复杂型糖蛋白，而是高甘露糖型或过度甘露糖化糖蛋白。杨晓鹏等人[5]在前期成功敲除毕赤酵母α-1,6-甘露糖转移酶(Och1p)基因、阻断毕赤酵母过度糖基化，获得毕赤酵母过度糖基化缺陷菌株GJK01 (ura3、och1) 的基础上，构建了PGE-URA3-PNOI-GAP-signal-MDSI载体，通过表达不同物种来源的α-1,2-甘露糖苷酶I (MDSI) 的活性区与酵母自身定位信号的融合蛋白，并通过DSA-FACE (基于DNA 测序仪的荧光辅助糖电泳) 分析筛选报告蛋白HSA/GM-CSF (人血清白蛋白与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白) 的糖基结构，发现当编码酿酒酵母α-1,2-甘露糖苷酶 (MnsI) 基因的内质网定位信号与带有完整C-端催化区的拟南芥MDSI基因融合表达时，毕赤酵母工程菌株能够合成Man5GlcNAc2 哺乳动物甘露糖型糖蛋白。这为在酵母体内合成类似于哺乳动物杂合型或复杂型糖基化修饰的糖蛋白奠定了基础。

4．在巴斯德氏毕赤酵母中高水平表达一种合成酶——植酸酶

植酸（Phytate）,即肌醇六磷酸（IP6），是植物种子中磷元素的主要储存形式, 普遍存在于植物性食品和饲料。人和单胃动物畜禽和鱼类等缺乏内源性植酸酶不能利用有机植酸磷。饲料中常添加无机磷酸盐以满足单胃动物的磷营养需求，随之产生了诸多问题，最主要的是植酸作为一种抗营养因子，在体内络合多种矿质元素和蛋白质等，常引起人和单胃动物各种营养不良症，而且未被利用的植酸磷被微生物降解释放无机磷易引发水体磷污染。植酸酶（Phytase）是一类特殊的正磷酸单酯磷酸水解酶，催化植酸水解生成低级肌醇磷酸衍生物和无机磷酸，在动物营养、资源环境保护和人类健康等领域愈来愈显示出巨大的应用潜力和研究价值。植酸酶普遍存在于植物、真菌、酵母和细菌，其中微生物植酸酶因活性高、生产比较容易等诸多优点，对其研究和开发最为广泛和深入。Ai-Sheng Xiong等人利用一种担子菌隔孢伏革菌(Peniophora lycii)的植酸酶[6]（一种6’-植酸酶）基因，优化出适合P. pastoris的密码子的基因序列——phy-pl-sh，连接上信号肽MF4I的基因，采用含有AOX1启动子的pPIC9K载体，转化并使毕赤酵母GS115合成并分泌了植酸酶，产量为12.2g/L.控制的培养条件是：30°C，pH5.5，溶氧量30%，高密度培养。酶蛋白检测和酶活测试发现，酶的糖基化较严重，用水解酶Endo Hf在37°C下处理提纯的酶蛋白4h，得到的片段较均一，且在pH4.5下具有最大