酵母表达系统概述及相关研究进展(3)

酵母双杂交系统

量和可靠的青蒿素来源。这个实验通过改造甲羟戊酸途径，引入两个来自青蒿（Artemisia annua）的外源酶amorphadiene synthase (ADS)和cytochrome P450 monooxygenase(CYP71AV1)使酿酒酵母获得将amorpha-4,11-diene氧化为artemisinic acid的三步途径。同时，还导入了CYP71AV1的天然氧化还原配体CPR (cytochrome P450 oxidoreductase)，在这之前，还需将法尼基焦磷酸即FPP（farnesyl pyrophosphate）的合成途径修饰，减少它用于固醇的合成，使之更多的用于合成amorphadiene。然后，利用改造的酿酒酵母EPY224生产artemisinic acid，不仅纯度较高，易于提取分离，而且不受气候影响。

2．利用毕赤巴斯德氏酵母生产人源抗菌肽——LL-37

抗菌肽是生物体抵御外源性病原体的防御反应中所产生的一类小分子多肽。许多传统的抗生素具有毒副作用且能够诱导耐药菌株的产生，发展克服耐药性问题的新型抗生素显得越来越重要。抗菌肽具有分子质量小、水溶性好、耐热性强、无免疫原性、抗菌谱广和作用机制独特等特点，还有研究表明，hCAP （Human cathelicidin antimicrobial peptide）是人皮肤在受伤或炎症刺激下，嗜碱性粒细胞分泌的一种防御或抗微生物的肽，在人类中只有LL-37一种。固相化学合成技术可以生产像肽这样较短的氨基酸序列，不过成本太高。Yong-Seok Kim等人[3]利用pGAPZ-E（pGAPZB载体的游离形式）将编码成熟LL-37的111bp的基因片段采用电穿孔方法转化到P. pastoris X-33中，进行细胞内表达，表达的重组LL-37通过LC-ESI-MS/MS检测确定，发现有5kDa的LL-37条带。酵母的表达出来的LL-37的粗提取物对Micrococcus luteus具有抑制活性。表达载体采用GAP强启动子，另外还进行了有a-MF外分泌信号的载体pGAPZaA，结果采用这个载体的X-33培养物中没有发现胞外分泌的LL-37.另外还利用蛋白酶缺陷型菌株SMD1168H进行了转化，LL-37在其中的表达水平与在X-33中的没有显著差异。这个实验说明了利用游离型表达载体在P. pastoris X-33中可以成功表达LL-37，并且具有生物活性，可以用于生产这类抗菌肽药物。

3．人源化的毕赤酵母生产糖蛋白类药物

人体内，除了抗体外的大多数糖蛋白的半衰期和治疗潜力依赖于末端的唾液酸化，这是由于一个糖蛋白的其它末端糖比如甘露糖，N-乙酰葡糖胺和半乳糖等会被体内的糖特异性受体或凝集素识别并被清除，也就失去疗效了。酵母和丝状真菌在表达这类糖蛋白方面具有一定前景。用酵母表达在人体内具有活性的糖蛋白需要进行很多基因删除或修饰，Tillman U. Gerngross等人[4]利用毕赤酵母构建出能表达重组红细胞生成素（EPO）的菌株P. pastoris YSH597。这个菌株是在以前的菌株RDP762基础上利用pSH926载体引入了5个新的外源基因构建成的，为的是使这个酵母能完成人源的末端唾液酸化。对天然酵母的改造设计到四个酵