酵母表达系统概述及相关研究进展(5)

酵母双杂交系统

酶活力。对基因稳定性和酶的热稳定性检测发现效果良好，此外他们还利用DNA Shuffling获得了几种热稳定的酶的候选基因，这项研究表明利用毕赤巴斯德氏酵母生产6’-植酸酶具有很大潜力，可以用于工业生产。

5．毕赤酵母表达大分子类药物

在毕赤酵母表达系统表达具有生物活性的CTP-SOD 融合蛋白，显著地提高了SOD 保护HeLa 细胞免受氧化损伤的能力。细胞质转导肽 (CTP，一种能够携带外源大分子穿过细胞膜，定位于细胞质的短肽)运输人铜锌超氧化物歧化酶 (Cu/Zn SOD) 跨过细胞膜进入细胞质，可以提高其生物利用度。李沛志等[7]利用P. pastoris GS115(his4-)及其整合型分泌表达质粒pPIC9K转化表达了融合蛋白CTD-SOD。首先，设计含有CTD转导肽基因序列的融合基因，连接至pPIC9K 质粒并用它转化E. coli Top10并进行菌落PCR筛选，抽提出重组质粒并电击转化巴斯德毕赤酵母，将转化成功的酵母接种到YPD 培养基中，通过加入甲醇至终浓度0.5％诱导表达。培养结束后分析发酵液中诱导蛋白的表达量，纯化后并进行对细胞的保护作用测试。本研究成功地在毕赤酵母表达系统中高效表达了具有生物活性的CTP-SOD 融合蛋白，发酵上清中重组蛋白的含量为156.5 mg/L 。纯化得到的CTP-SOD 分子量约为22.5 kDa。CTP-SOD 预处理Hela 细胞可显著地提高了邻苯三酚 (Progallol) 诱导氧化胁迫下HeLa 细胞的存活率，较野生型SOD 相比具有较强的保护作用。但是，CTP 和其他种类的PTD（蛋白转导域，Protein transduction domain） 相比是否更有利于SOD或其他在细胞质中起作用的药物发挥功能都有待进一步深入的研究来证明，具有跨膜转导能力的新一代药物运输载体PTD 将会促进多肽、核酸等大分子药物的快速发展，为生物大分子药物的应用带来更广阔的前景。

在哺乳动物中, 三叶型家族(trefoil factorfamily, TFFs)蛋白通过增强细胞迁移，促进细胞增殖，对抗细胞凋亡等过程参与黏膜的修复并维持其完整性。Bm-TFF2, 一种从大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的两栖类三叶因子, 具有比人三叶因子更强的生物学活性。余果宇等人

[8]以Bm-TFF2 的cDNA 为模板, 利用PCR 方法扩增Bm-TFF2 基因, 然后插到含有AOX1 启动子和α-因子信号肽序列的表达载体pPIC9K 中, 采用毕赤酵母表达系统进行分泌表达, 并用G418 筛选高拷贝整合转化子。SDS-PAGE 和Western blotting 都检测到Bm-TFF2 被分泌性表达于酵母上清。在1%的甲醇诱导表达不同时间后, 重组蛋白在72 h 的表达量最大, 可达50 mg/ L; 而不同浓度的饱和硫酸铵沉淀菌液上清时, 80%的饱和硫酸铵沉淀量最大。这些结果表明, 重组质粒Bm-TFF2-pPIC9K 成功构建并在真核细胞中高效表达, 这为进一步研究Bm-TFF2 的生物学活性及其结构与功能关系奠定了基础。