人脐血来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

人脐血来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

中文摘要

目的：

诱导脐血来源内皮祖细胞分化为内皮细胞，探索分离、培养以及鉴定脐血来

源的内皮祖细胞方法，探讨其用作组织工程心血管修复物种子细胞来源的可行

性。

材料和方法：

新鲜脐血１５份，采用６％羟乙基淀粉沉降法和密度梯度离心法联合应用分离

脐血单个核细胞。根据所用的细胞培养液的不同，将实验分两组：诱导组和未诱

导组。诱导组是在含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ加ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ等多种生长因子的条

件培养液中培养；未诱导组是在含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ不加生长因子的基本培养

液中培养。从以下几个方面对脐血来源内皮祖细胞进行鉴定：在倒置相差显微镜

下进行贴壁细胞形态学观察，电镜下观察细胞特征性的超微结构，免疫荧光显微

镜和流式细胞仪检测内皮细胞特征性表面标志ｖＷＦ、ＶＥＧＦＲ－２和ＣＤｉ３３，测定

细胞培养液中一氧化氮（ＮＯ）含量分析细胞的功能，观察细胞的增殖能力等。

结果：

从新鲜脐血中得到的单个核细胞数平均为（３．４＋２．１）Ｘ１０７／ｍＬ。诱导组

贴壁细胞培养分化过程中细胞形态发生了改变，从小圆形变成梭形，形成集落样

生长，２周左右分化成典型成熟内皮细胞的铺路石样形态。而未诱导组细胞集落

少，未见铺路石样形态细胞。７天后免疫荧光检测发现诱导组细胞明显表达内皮

细胞特异性标志ｖＷＦ和ＶＥＧＦＲ－２，偶有ＣＤｌ３３表达。而未诱导组无此明显阳

性反应。流式细胞仪分析诱导组单个核细胞经诱导分化后细胞表面表达ＣＤｍ下

降，从（３．１１±１．０５）％下降至（Ｏ．０９＿＋０．０２）％，Ｐ＜０．０５。透射电镜观察到诱导组

培养１４天的细胞胞浆中已出现典型的内皮细胞超微结构，即Ｗｅｉｂｅｌ—Ｐａｌａｄｅ小体。

培养１４天培养液中ＮＯ含量测定的结果显示：未诱导组、诱导组和人成熟脐静

脉内皮细胞培养液中ＮＯ含量分别为（１２．４３±４．５１）ｕｍｏｌ／Ｌ、（５２．０７±２．１７）ｕｍｏｌ／Ｌ

和（８３．６５±６．１４）ｕｍｏｌ／Ｌ，３组数据间两两比较Ｐ值均＜ｏ．０５。诱导组培养液中ＮＯ

含量显著高于未诱导组，但低于成熟内皮细胞，细胞已具备部分成熟内皮细胞的

功能。诱导组细胞较未诱导组细胞增殖快，细胞原代培养２周左右，细胞数量即可达到１０５左右。