４．弃上清，重悬细胞于ＰＢＳ缓冲液中，按２：１比例将细胞悬液轻轻平铺于

Ｆｉｃｏｌｌ．Ｐａｑｕｅ表面，４℃，２０００ｒ／ｒａｉｎ，密度梯度离心３０ｍｉｎ。

５．离心后，可见离心管中液体分成三层，上层为血浆和ＰＢＳ液，下层主要为红细

胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单核细胞为主的

白膜层，小心吸取中间白色膜状层单个核细胞。ＰＢＳ洗涤两次，离心弃上清。

６．收获的单个核细胞分别于ＤＭＥＭ基本培养液和ＤＭＥＭ条件培养液中分组培

养。

３原代诱导分化培养及传代

１．原代培养

人纤维连接蛋白（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ，ＦＮ）用ＰＢＳ稀释成２０ｎｇ／ｕＬ后，包被７５ｅｒａ２

培养瓶，置于３ＴＣ培养箱中孵育３０ｍｉｎ后，轻轻吸去表面多余液体。分别用低

糖ＤＭＥＭ条件培养液和ＤＭＥＭ基本培养液重悬分离好的单个核细胞，调整细

胞浓度为５×１０６／ｍＬ，接种于包被好人纤维连接蛋白的７５ｃｍ２培养瓶中，置于

饱和湿度，５％Ｃ０２的培养箱中培养，４ｄ后首次以双倍浓度细胞因子培养基半量

换液，以后每过３ｄ半量换液，倒置相差显微镜下观察贴壁细胞的形态变化和增

殖情况。

２．传代培养

当原代细胞诱导培养后，细胞铺满培养瓶８０－－８５％时，以Ｏ．２５％胰蛋白酶

－０．０１％ＥＤＴＡ混合液进行室温消化，显微镜下控制时间，待贴壁细胞收缩为圆形，

细胞间隙增加，细胞间连接松散后，弃消化液，加入含ＦＢＳ的ＤＭＥＭ中止消化，

轻轻吹打细胞，镜下观察绝大多数贴壁细胞悬浮于培养液后，洗涤后计数，以１：

２￣３比例接种进行传代。传代培养后每３ｄ换一次液，倒置相差显微镜下观察细

胞的形态变化和增殖情况。

４内皮祖细胞的观察和鉴定

１．形态学观察：每天在倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化。

２．表面标志鉴定：应用免疫荧光法、流式细胞仪检测细胞表面ＣＤｍ、ＶＥＧＦＲ－２

和ｖＷＦ的表达。

（１）免疫荧光法：检测培养７ｄ贴壁细胞ＶＥＧＦＲ－２和ｖ、ＶＦ抗原的表达。

１）细胞经４％多聚甲醛固定２０ｍｉｎ、１％Ｔｒｉｔｏｎ打孔２０ｒａｉｎ，，以增加细胞膜的通９