Primer Premier 5.0中文使用说明书

请注意上图就显示一个好的引物3末端稳定性较弱而5末端有一个较强的GC钳Repeats and Runs

重复和循环

PRIMER PREMIER自动剔除任何有三个及以上的重复或循环碱基的引物例如引物包含ATATAT这样AT被重复三次那么这个引物将被剔除您可以设定可以接收的碱基重复的数量Secondary Structures

二级结构二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素二级结构能显著影响反应中能与模板正确结合的引物数量发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力从而降低扩增效率形成发卡环的引物则不能在PCR扩增中发挥作用

发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成引物折叠形成的二级结构并由于发卡结构的形成是分子内的反应仅仅需要三个连续碱基配对就可以形成发卡结构的稳定性可以用自由能衡量自由能大小取决于碱基配对释放的能量以及折叠DNA形成发卡环所需要的能量如果自由能值大于0则该结构不稳定从而不会干扰反应如果自由能值小于0则该结构可以干扰反应

按下按钮

All可以使用PRIMER PREMIER软件中的Hairpin Report功能帮助您回避类似二级结构Dimer

二聚体引物之间的配对区域能形成引物二聚体它是相同或不同的两条引物之间形成的二级结构它造成引物二聚体扩增并减少目的扩增产物二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向引物之间形成如果配对区域在3末端问题会更为严重3末端配对很容易引起引物二聚体扩增使用Dimer Report功能可以预测二聚体的形成

如果引物可以结合除目的位点外的其他区域扩增效率将明显降低目的产物带将减少或出现涂布

smearPRIMER PREMIER会检查每一条引物是否会与整个序列的其他位点形成局部的错配

3末端连续几个碱基配对形成错配的倾向要高于引物上游区域同样数量的碱基配对您可以分别设定确认为错配的3末端或引物全长形成连续碱基配对的数量Pair Rating匹配度评分匹配度低的引物对常常不太有效是因为在同样退火温度下Tm低的引物决定扩增的特异性而Tm高的引物更易于形成非特异性结合而造成错误的起始PRIMER PREMIER会计算

每一对引物的匹配度100

分为满分并按照分数按降序排列计算引物对匹配度以及单个引物评分的公式请参看本说明的附录Search Results搜索结果

当您点击搜索程序窗口的

OK

按钮接受搜索结果后

Search Results

搜索结果窗口将会打开它显示了搜索中找到的所有引物或引物对

如果您选择了一条引物或一对引物对在PRIMER PREMIER窗口上将即时显示引物的分析结果与当前的序列配对的引物的位置和序列也会在Direct Select框上显示可选操作

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