2010 级生物技术专业微生物技术方向《微生物遗传育种》复习思考题

《微生物遗传育种》复习思考题

01 绪论 1 、工业微生物菌种应具有哪些基本特征？

非致病性；适合大规模培养工艺要求；利于规模化产品加工工艺；具有相对稳定的遗传 性能和生产性状；形成具有商业价值的产品或具有商业应用价值。 2、简述工业微生物遗传育种的分类。

天然菌种（native strain）：通过自然筛选和分离获得的工业菌种；诱变菌种（mutagenized strain）：通过物理、化学等诱变剂在实验室人工诱变自然筛选与分离的菌株所获得产量或/ 和性状改善的工业菌种；重组菌种（recombinant strain）是通过遗传重组技术对菌种进行定 向遗传改良获得的工业菌种；遗传修饰生物体（genetic modification organisms, GMOs）：经

外源基因导入并因此发生遗传整合和性状改变的生物体。 3、试从微生物遗传学的不同角度阐述你对微生物多样性的认识。 一、微生物物种的多样性; 二、微生物遗传的多样性;三、微生物代谢的多样性 ;四、微生 物的生态多样性;五、微生物利用的广泛性

02 第四章 工业微生物育种诱变剂 1、什么是诱变剂？可分为哪几种类型？ 诱变剂：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化学

物质.可以分为三类：物理诱变剂；化学诱变剂：一类能对 DNA 起作用，改变 DNA 结构， 并引起遗传变异的化学物质；生物诱变剂：采用某些噬菌体来筛选抗噬菌体突变菌株时，常 常发现伴随着出现抗生素产量明显提高的抗性突变株。因此，可以认为这些溶源性噬菌体是 一种生物诱变剂。 2 、什么是突变？突变的表现型有哪些？基因突变的特点有哪些？

突变，从广义上讲，除了转化、转导、接合等遗传物质的传递和重组引起生物变异以外， 任何表型上可遗传的突变都属突变范围，如染色体整倍性和非整倍性的变化及染色体结构上 的畸变等都包括在内。 1、形态突变型，是一种可见突变，它包括微生物菌落形态变化，如菌落形状大小、颜色、 表面结构等；2、生化突变型，；3、条件致死突变型；4、致死突变型；5、抗性突变型；6、 营养缺陷型；

普遍性；随机性（基因突变可以发生在生物个体发育的任何时期和生物体的任何细胞。 突变发生的时期越早，表现突变的部分越多，突变发生的时期越晚，表现突变的部分越少。）； 突变率低；多数有害；不定向性（一个基因可以向不同的方向发生突变，产生一个以上的等 位基因。 3 、突变后其基因型是否会很快表现？为什么？

变基因的出现并不意味着突变表型的出现，表型的改变落后于基因型的改变，即表型延

迟，微生物通过自发突变或人工诱变而产生新的基因型个体所表现出来的遗传特性不能在当 代出现，其表型的出现必须经过 2 代以上的繁殖复制。表现延迟的原因有：1、与诱变剂性 质和细胞壁结构组成有关；2、当突变发生在多核细胞中的某一个核，该细胞就成为杂核细 胞了；3、原有基因产物的影响。（产生原因：①分离性迟延现象②生理性迟延现象） 4 、物理诱变剂主要有哪几类？请举例？

物理诱变剂包括：紫外线，X 射线，γ射线，快中子，α射线，β射线，微波，超声波， 电磁波，激光射线和宇宙射线等 5 、化学诱变剂主要有几大类？

碱基类似物；烷化剂；脱氨剂；移码诱变剂；羟化剂；金属盐类；其他化学诱变剂

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6、使用化学诱变剂时需要注意什么？、 在进行化学诱变处理时，控制使用剂量要以诱变效应大，而副反应小为原则。处理时的 温度对诱变效应也有一定影响。绝大多数化学诱变剂都具有毒性，其中 90%以上是致癌物 质或极毒药品，使用时要格外小心，不能直接用口吸，避免与皮肤直接接触，不仅要注意自 身安全防止污染环境，造成公害。 7、根据你所学的诱发突变的知识，你认为能否找到一种仅仅对某一基因具有特异性诱变作 用的化学诱变剂？为什么？ 不能找到具有特异性诱变作用的化学诱变剂，因为对于一般的化学诱变剂：碱基类似物、

碱基修饰剂、移码突变剂，均不具有特异性。 诱变的特异性是靠识别碱基对来进行的，而任一 个基因都不可能有完全特异的碱基对供识别。突变是随机性的。因为从分子生物学的角度来看， 所有的基因都是存在于 DNA 双链中，基因的信息都存在于由 ATCG 碱基对的排列顺序中。即 使有某些物质可以特异的识别某几个碱基的排列顺序，但这种排列也存在于其他基因之中，诱 变是在整个基因组范围内发生的。所以从现有的科研水平来看，不存在有特异性的理化诱变 剂。 现在对基因的诱变可以通过传统的遗传学方法实现，可以构建带有诱变位点的基因载体， 转入生物体中，达到特异诱变的目的 。 8、表现延迟：微生物通过自发突变或人工诱变而产生新的基因型个体所表现出来的遗传特 性不能在当代出现，其表型的出现必须经过 2 代以上的繁殖复制。

03 第五章 菌种分离筛选 1、工业微生物的来源？ 1、向菌种保藏机构索取有关菌株，从中筛选所需菌株；2、由自然界采集样品，如土壤、 水、动植物体等，从中进行分离筛选；3、从一些发酵制品中分离目的菌株。 2、从土壤中筛选微生物时，采样应该注意一些什么问题？ 根据土壤特点：1、土壤有机质含量和通气情况；2、土壤酸碱度和植被状况；3、地理条 件；4、季节条件；采样方法：用取样铲，将表层 5cm 左右的浮土除去，取 5-25cm 处的土 样 10-25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好。 3、什么叫富集培养？ 是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有 利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件 下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。

4、纯种分离的方法有哪些？简述菌种分离和筛选的步骤。 纯种分离通常采用梯度稀释涂

布法和划线法。 划线法是用接种针挑取微生物样品在培养基上直接划线（一般采用梯度划线法），培养后

获得单菌落。划线法简便、快速，但所得到的单菌落不一定是纯种（可采用多次转接划线加 以弥补）。

稀释法是先将样品经无菌水或灭菌生理盐水 梯度稀释后，再涂布到固体培养基上，培 养后获得单菌落。稀释法使微生物样品分散更加均匀，获得纯种的概率更大。 通过控制营养和培养条件进行纯种分离：一般都采用筛选性平板辅以筛选性培养条件（1）

控制分离培养基中的营养成分（碳氮源） （2）控制培养基的 pH 值（采用缓冲体系） （3）

控制培养温度（嗜热性、大类特性如细菌 35，霉菌 27 度）（4）供氧条件的控制（厌好氧）利 用生化反应进行分离（初步分离）：根据目的微生物的特殊生理特性或其代谢产物的生化反 应进行设计。

常用方法：

（1）透明圈法（培养基浑浊） （2）变色圈法（指示剂或显色剂）

（3）生长圈法（采用营养缺陷菌作为指示） （4）抑菌圈法（抗生素敏感菌作为指示）

可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤。

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04 第六章 微生物诱变育种 1、用野生型的大肠杆菌为出发菌株，可用哪种诱变剂怎样进行诱变得到 Leu突变株，如何 检出和鉴定该突变株？ -2、诱变育种工作中如何制备菌悬液？ 在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞的均匀悬

液状态。原因：1、分散状态的单细 胞可以均匀地接触诱变剂；2、可避免长出不纯菌落。菌悬液由出发菌株的孢子或菌体细胞 用生理盐水或缓冲液制备而成，其质量将直接影响诱变效果。

1、供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮；2、菌悬液制备方法：细菌经 20h-24h 培养的新鲜 斜面，移接到盛有基本培养基的三角瓶中，于 35-37℃振荡培养到对数期，在于 6℃培养 1h 使之同步生长，然后加入一定密度的嘧啶、嘌呤或酵母膏，继续振荡培养 20-60min。置于 低温 10min，离心洗涤，用冷生理盐水或缓冲液制备菌悬液，放在盛有玻璃珠的三角瓶内振 荡 10min,令其分散，用无菌脱脂棉或滤纸过滤。通过菌体计数，调整菌悬液的浓度供诱变

处理。 3、根据突变的光复活修复作用、原理，你认为在进行紫外线诱变处理时，应注意什么 ?为

了使被诱变的细胞能均匀地受到紫外线照射，你将如何做？ 在紫外线照射时，盛菌液的培养皿应置于磁力搅拌器上，边照射边搅拌使细胞能均匀受 到紫外线照射。 4、紫外线引起的胸腺嘧啶二聚体对微生物有何影响？哪些修复系统可对此进行修复，其结 果如何？ 微生物在正常情况下进行 DNA 复制时，首先 DNA 双链解开成为单链，然后两条单链各自 与细胞内游离的碱基互补配对形成新链。如果此时双链之间有嘧啶二聚体存在，则因二聚体 的交联作用，阻碍双链分开，复制到此处就无法进行下去，造成 DNA 异常状态。如果在一 条单链上出现嘧啶二聚体，则会影响复制过程碱基的正常配对。在正常情况下 T 与 A 配对， 若二聚体形成，就要破坏 A 的正常掺入，复制就会在这一点突变停止或错误进行，以致在 新形成的链上有了一个改变了的碱基序列。

有光修复、切补修复、重组修复、SOS 修复系统。还有聚合酶的校正作用。

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光修复、是一种高度专一的修复方式，只作用由紫外线引起的 DNA 嘧啶二聚体的修复 切补修复、发生在 DNA 复制之前，是对模板的修复，如大肠杆菌的 Uvr 修复系统，负责切 除大量的胸腺嘧啶二聚体。 重组修复、不将损伤碱基除去，而是通过复制后，经染色体交换，使子链上的空隙部位不再 正对 T=T，而是面对正常的单链。其中 Rec 系统负责消除那些没有被切除修复系统所切除 的 T=T 可能造成的可怕的后果。

SOS 修复系统、松懈 DNA 复制校对系统，允许新生 DNA 链越过 T=T 而延伸，不去管双螺 旋结构的变形。导致错误的碱基出现在生长链的任何位置，数量太大，错配修复和切除修复 系统纠正一些，仍留有很多错配碱基，从而造成突变。 光修复、切补修复和聚合酶修复都是修复模板链。而重组修复是形成一条新的模板链，SOS 是产生连续的子链。SOS 修复是唯一导致突变的修复，其余的修复机制都是将 DNA 损伤恢 复到损伤前的状态或产生与亲本完全相同的子代 DNA。

5、某人将一细菌培养物用紫外线照射后，立即涂布在加有链霉素（Str）的平板上，放在有 光

条件下培养，从中筛选 Str 抗性突变株，结果没有长出 Str 抗性菌落，试分析失败的 原因？ 1、紫外线诱变后见光培养，造成光修复，使得突变率大大下降，以致选不出 str 抗性菌 株；2、紫外线的照射后可能根本没有产生抗 str 的突变。

6、紫外线诱变育种的作用机制。 紫外线诱变一般采用 15W 紫外线杀菌灯，波长为 2537A．灯与处理物的距离为 15～30cm，

照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射 的剂量死亡率控制在 70～80%为宜。被照射的菌悬液细胞数，细菌为 106 个/mL 左右，霉菌 孢子和酵母细胞为 106～107 个 /mL。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约 0.5～ 1.0cm 厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活 效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。

7、何为基本、完全、补充培养基？ ⑴ 基本培养基：凡是能满足某种野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基，称为基 本培养基；常以‘[-]’表示；⑵完全培养基：在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素 及含氮碱基之类的天然有机物质如蛋白胨、酵母膏等，以满足该微生物的各种营养缺陷型菌 株都能生长繁殖的培养基，称为完全培养基，常用‘[+]’表示；⑶补充培养基：在基本培 养基中只是有针对性地加入某一种或某几种营养缺陷成分，以满足相应的营养缺陷型生长的 培养基，称为补充培养基，补充培养基可按所加入营养成分相应地用‘[A]’、‘[B]’等来表 示。

8、何为野生型、营养缺陷型、原养型？ 营养缺陷型（auxotroph）：经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养基内加

入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。如：lys - ；his - ；野生型(wild type)：自然界 分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为该微生物的野生型。如：lys+； his+ ;原养型 (prototroph) ：指 auxo 突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的 表型相同。 9 、淘汰野生型的目的、原理及方法如何？

目的：使缺陷型菌株得以富集，以利于检出； 原理：限制营养成分使缺陷型细胞生长受抑制，野生型细胞在生长过程中被杀死或生长后

被除去。

方法：1）抗生素法：野生型能在 MM 中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在 MM 中

培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。由于细 菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型 就被杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。2）菌丝 过滤法：适用于丝状菌（放线菌、霉菌）。原理：野生型在基本培养基上发 育成菌丝，

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不能 通过滤膜；营养 缺陷型孢子可通过滤膜，野生型 菌丝不能通过。3）差别杀菌法： 基本培养基上只有野生型生长，加热杀死野生型营养体，保留营养缺陷型芽孢。 细菌—— 80℃ 酵母——60 ℃适用于产芽孢、孢子菌。

10、如何检出和鉴定营养缺陷型突变株？ 原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情

况完全不同，缺陷型在 CM 上生长 良好，而在 MM 上则不生长，野生型都能生长。

检出具体方法：影印法 1．将一较平皿直径小 1cm 的金属圆筒蒙上一层灭菌的丝绒，用金属 夹夹住，灭菌。2．将完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻一压，使之成为印模，标 记方位。3．将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的同一方位上先后轻轻一压，此菌 印模即复印于上。4 ．将 CM 和 MM 在恒温箱中培养。5．二平皿相同方位进行比较， 即 可发现在 MM 平皿上长出的菌落少于 GM 平板上的。MM 上未长而相应于 CM 上长出的那

几个菌落就可能是缺陷型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。 点种 法（点植对照法）也就是任意法。用接种针或牙签将 CM 上长出的菌落在 MM 和 CM 两副

平板上接种，依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况。此法结果明确，但工 作量大。夹层法先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基，凝固后涂上一层含菌的 MM，凝固后 再倒一薄层 MM 琼脂培养基，培养 24h，将出现的菌落标记，然后倒上一层 CM 琼脂培养 基，再培养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型。此法缺点是，结果有时不明确，而且

将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。限量补充培养法。 鉴定方法：① 含营养缺陷型菌株的基本培养基平板的制备。② 营养缺陷型营养类别的鉴定。 ③ 缺陷型菌株单一营养因素的鉴定。 可分为两类：一种方法是在一个平皿中加入一种营养物质以测定多株缺陷型菌株对该生长因 子的需求情况；第二种方法是在同一平皿上测定一种缺陷型菌株对许多种生长因子的需求情

况，成为生长谱法。步骤：测定缺陷型菌株所需生长因子的类别—具体测缺陷该类别物质中 的哪种生长因子—用单一生长因子进行复证试验。1）缺陷型类别的鉴定；2）缺陷型所需生 长因子的测定。

11、用什么方法可获得大肠杆菌（E. coli）的组氨酸缺陷型？ 营养缺陷型菌株的筛选一般要经过：（1）诱发突变 （2）淘汰野生型菌株 （3）检出营养缺 陷型 （4）鉴定营养缺陷型 4 个环节。将筛选得到的缺陷型菌株分别涂在不加任何氨基酸的 基本培养基和加有组氨酸的基本培养基上，过夜培养一段时间后观察，若前者不长后者长出 菌落，即为组氨酸缺陷型。

12、试述筛选营养缺陷型菌株的方法，并说明营养缺陷型菌株在应用上的作用。

（1）诱发突变 （2）淘汰野生型菌株 ① 抗生素法② 菌丝过滤法 原理：野生型在基 本培养基上发 育成菌丝，不能 通过滤膜；营养 缺陷型孢子可通过滤膜 ，野生型 菌丝不能 通过：高温杀菌法（3）检出营养缺陷型 点植对照法影印法夹层法④限量补充培养 法（4）鉴定营养缺陷型 作用：1、可作为标记菌种；2、利用缺陷型可以获得某些代谢的中间产物，因此在生产 上可作为生产菌种，氨基酸、核苷酸等；3、作为氨基酸、维生素、碱基的测定菌株；4、营 养缺陷型在杂交育种中是不可缺少的工具；5、可以用来研究生物合成途径。 13、在营养缺陷型突变株的筛选过程中，淘汰野生型的目的是什么？并写出 3 中主要方法

及其原理。 目的是：使缺陷型菌株得以富集，以利于检出； 1）抗生素法：野生型能在 MM 中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在 MM 中培养 短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。由于细菌或 酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被 杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。 2）菌丝过滤法：适用于丝状菌（放线菌、霉菌）。原理：野生型在基本培养基上发 育成菌 丝，不能 通过滤膜；营养 缺陷型孢子可通过滤膜，野生型 菌丝不能通过。

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