基于HLA组特异性单倍体全长测序方法对模棱两可(7)

背景：传统的HLA测序分型技术都是对父系母系双倍体进行扩增,由于HLA多样性高,产生了大量的模棱两可难题,而采用基于组特异性单倍体全长测序分型方法来解决模棱两可结果的确认定型鲜有报道。目的：分析基于组特异性单倍体全长测序分型方法对HLA基因分型模棱两可结果准确定型的效果。方法：对2例模棱两可结果标本以低分辨率分型方法结果作为参考起点,通过组特异性扩增分离,基于等位基因全长单倍体的Sanger测序(PCR-SBT)分型。

王宋兴，等. 基于HLA 组特异性单倍体全长测序方法对模棱两可结果的准确定型 P .O. Box 10002, Shenyang 110180

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两可分型结果为C*07∶02∶01∶01杂合新等位基因，该基因与C*08∶01∶01比较，在NT879由A 发生突变为G ，由于其也发生在第三外显子上，故引起第144位密码子由CAG 变为CGG ，从而导致其编码的氨基酸由谷氨酰胺变成精氨酸。然而这两个氨基酸的改变是否也会影响相应的蛋白表达，仍需更深入的进行后续的跟踪试验。

在本研究中，因为试验实施期间其他位点样本短缺，所以仅列举采用该试剂盒基于HLA 组特异性单倍体全长测序方法能解决HLA-A 和HLA-C 模棱两可结果，而实际上，根据作者前期的试验和试剂说明书的说明，对于HLA-B 、 -DRB1和-DQB1模棱两可结果也是同样有效的。前面作者描述了联合开发用于HLA-A 、-B 、-C 、-DRB1和-DQB1基因分型的基于HLA 组特异性单倍体全长测序的无歧义SBT Sanger 方法，该试剂盒根据HLA-A 、-B 、-C 、-DRB1和-DQB1基因的组特异性分类，分别设计基因全长单倍型组特异性扩增引物对HLA-A 、-B 、-C 、-DRB1和-DQB1基因需要分型的外显子及内含子区域进行PCR 扩增；完成扩增后，为每个基因设计一套通用正反向全长测序引物对HLA 基因所有外显子及内含子进行测序。该试剂盒以低分辨分型结果作为参考和起点，可对HLA-A 、-B 、-C 、-DRB1和-DQB1基因所有等位基因进行测序分型，有效解决模棱两可，达到绝对高分；组特异性扩增引物的设计可避免发生漏检；单倍型扩增测序结果，单峰一目了然，分析方便快捷。该方法已被涵盖所有不同的等位基因组样品验证可行，并已自2011年开始在常规实验室诊断中实施使用。通过这种改进的方法，模棱两可结果被显著的减少，HLA-A 为4.4%，HLA-B 为4.4%，HLA-C 为0%[37]。剩余的极少部分模棱两可结果就需要采用聚合酶链反应－序列特异性引物法(PCR-SSP)等其他方法来补充。PCR-SSP 从理论上可以解决所有的模棱两可分型结果，但该方法本身存在如引物设计工作量大、难以实现高通量等明显缺点，使其难以作为大规模分型实验中解决模棱两可分型结果的主要方法，但可作为辅助方法少量应用，以弥补其他方法的不足[38-42]。

综上所述，基于HLA 组特异性单倍体全长测序分型方法可以准确定型模棱两可结果并发现新等位基因。本文使用高分辨分型技术对低分辨分型技术的模棱两可结果进行鉴定，是因为目前低分辨分型结果基本能满足临床需要，而且低分辨试剂盒价格也相对低廉，但是越来越多的研究表明，高分辨分型结果对临床骨髓以及组织移植等指导意义重大，所以现在国内各配型实验室也在陆续更换使用高分辨分型试剂。另外，原来许多低分辨分型试剂厂家也不断改进和更新试剂盒，使其也能达到高分辨分型效果，从而大大降低模棱两可结果的出现，为临床移植配型和骨髓库供者分型提供更好的技术保障。

致谢：感谢荷兰马斯特里赫特大学医学中心免疫遗传和组织配型实验室Marcel GJ Tilanus 教授、Christina EM Voorter 博士以及深圳晋百慧生物有限公司于浩洋博士提供的支持。

作者贡献：实验设计由第一作者完成，实验实施为所有作者共同完成，评估为两位共同通讯作者一起完成，均接受过正规培训。

利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。

伦理问题：研究用人体组织的实验方案符合相关伦理学要求，文章的撰写与编辑修改后文章遵守了国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。

文章查重：文章出版前已经过CNKI 反剽窃文献检测系统进行3次查重。

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4 参考文献 References

[1]

Jun Z,Brian D,Michael S, et al. Rapid Detection of Donor Cell Free DNA in Lung Transplant Recipients with Rejections

Using Donor-recipient HLA Mismatch. Human Immunol. 2017; 78(4):342-349.

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