基于HLA组特异性单倍体全长测序方法对模棱两可(4)

背景：传统的HLA测序分型技术都是对父系母系双倍体进行扩增,由于HLA多样性高,产生了大量的模棱两可难题,而采用基于组特异性单倍体全长测序分型方法来解决模棱两可结果的确认定型鲜有报道。目的：分析基于组特异性单倍体全长测序分型方法对HLA基因分型模棱两可结果准确定型的效果。方法：对2例模棱两可结果标本以低分辨率分型方法结果作为参考起点,通过组特异性扩增分离,基于等位基因全长单倍体的Sanger测序(PCR-SBT)分型。

王宋兴，等. 基于HLA 组特异性单倍体全长测序方法对模棱两可结果的准确定型 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH

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性完成后迅速放到冰上冷却。变性后产物需在1 h 内上机测序，如不能当日上机，请置于-20 ℃条件下保存。 1.4.6 测序仪读板检测为便于及时上机检测，测序仪正式读取数据前30 min 请打开测序仪，相连电脑，最后打开软件。编辑Sample Sheet ，请特别注意核对待检测的标本编号为对应测序反应管号。将变性后的测序反应管按顺序放入测序仪上进行测序检测。按下启动按钮，收集原始数据。使用Assign SBT 软件进行数据分析，并最终产生HLA 分型报告。 1.4.7 质量控制

阳性质控品：HLA-A 阳性质控品检测结果为A*01∶01∶01∶01，HLA-C 阳性质控品检测结果为C*03∶02∶

02∶01。阴性质控品：HLA-A 、HLA-C 阴性质控品检测结果均为阴性，即PCR 扩增结束后，根据步骤1.4.2的方法进行电泳检测，电泳结果无条带。以上要求须在同一次实验中同时满足，检测结果才有意义；否则，应重复检测。每次实验均需检测阴性质控品和阳性质控品，质控品结果满足质量控制要求时方可进行检测结果的判定。检测结果阳性：电泳结果显示约3 kb 条带，测序峰图清晰，无背景杂峰，经软件分析后能得到HLA 型别。检测结果阴性：电泳结果不显示扩增带，无测序峰图。

1.5 主要观察指标对2例模棱两可结果标本以低分辨率分型方法结果作为参考起点，通过组特异性扩增分离，基于等位基因全长单倍体的Sanger 测序(PCR-SBT)分型。

表2 HLA 全长测序分型试剂盒(组特异性单倍型PCR-SBT 法)C 位点测序引物信息表 Table 2 HLA-C sequencing primers of Full-length Sequencing Kit (Group-specific Haplotype PCR-SBT Method)

Specificity Mix Sequencing primer Direction Region / Comment C*01, (*02)

MSC301

SC01 FW EX1 - I1 - EX2 - I2 - EX3 - I3 Standard

SC02 REV 5' UT - EX1 - I1 SC03 FW EX2 - I2 - EX3 SC04 REV 5' UT - EX1 - I1 - EX2 SC05 FW I2 - EX3 - I3 SC06 REV EX2 - I2 - EX3 SC07 FW I3 - EX4 SC08 REV EX3 - I3

SC09 FW I3 - EX4 - I4 - EX5 - I5 SC10 REV I3 - EX4

SC11 FW EX5 - I5 - EX6 - I6 - EX7 - I7 SC12 REV I3 - EX4 - I4 - EX5

SC13 FW I5 - EX6 - I6 - EX7 - I7 - EX8 SC14 REV EX4 - I4 - EX5 - I5 SC15 FW EX7 - I7 - EX8 SC16

REV I5 - EX6 - I6 - EX7 - I7 C*02 MSC302 Standard C*03

MSC303 Standard

SC17 FW EX1 - I1 - EX2 - I2

instead of SC01 C*03

MSC304

Standard Gene up to intron 7, alternative for MSC304

SC17 FW EX1 - I1 - EX2 - I2 instead of SC01 SC18 FW I5 - E6 - I6 - EX7 - I7 instead of SC15 SC19

REV EX5 - I5 - EX6 - I6 - EX7 instead of SC16 C*04,*18

MSC305 Standard C*05, *08 MSC306 Standard