背景：传统的HLA测序分型技术都是对父系母系双倍体进行扩增,由于HLA多样性高,产生了大量的模棱两可难题,而采用基于组特异性单倍体全长测序分型方法来解决模棱两可结果的确认定型鲜有报道。目的：分析基于组特异性单倍体全长测序分型方法对HLA基因分型模棱两可结果准确定型的效果。方法：对2例模棱两可结果标本以低分辨率分型方法结果作为参考起点,通过组特异性扩增分离,基于等位基因全长单倍体的Sanger测序(PCR-SBT)分型。

王宋兴，等. 基于HLA 组特异性单倍体全长测序方法对模棱两可结果的准确定型 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH

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Accurate determination of HLA ambiguous results based on group-specific haploid full-length sequencing

Wang Song-xing 1, Yang Hui 2, He Liu-mei 1, Hong Wen-xu 1, Zou Hong-yan 1, Xu Yun-ping 1 (1Institute of Transfusion Medicine of Shenzhen Blood Center, Shenzhen 518035, Guangdong Povince, China; 2Shenzhen Jin Baihui Biological Co., Ltd., Shenzhen 518035, Guangdong Province, China)

Abstract

BACKGROUND: Due to the polymorphism of HLA, a large number of ambiguities have been generated by conventional HLA typing techniques, and confirmed stereotypes of ambiguous results based on group-specific haploid full-length typing are rarely reported.

OBJECTIVE: To analyze the accuracy of HLA-typing ambigulity based on group-specific haploid full-length sequencing. METHODS: The low-resolution results were used as the starting point for two ambiguous samples. Sanger sequencing (PCR-SBT) based on haploid full-length was performed after group-specific amplification.

RESULTS AND CONCLUSION: One case showed a new A*02:03:01 allele, which was found a mutation in NT817 from C to T in comparison with A*11:01:01:01. The other case indicated another new C*07:02:01:01, which was found a mutation in NT879 from A to G in comparison with C*08:01:01. In conclusion, these results indicate that the

group-specific haploid full-length sequencing method can be used to accurately classify HLA alleles and to discover new alleles.

Subject headings: HLA Antigens; Genes; Tissue Engineering

Funding: the Medical Research Foundation of Guangdong Province, No. A2016222; the Special Foundation for

Strategic Emerging Industries Development in Shenzhen, No. JSGG20160328103642937; the Science and Technology Research and Development Foundation of Shenzhen, No. JCYJ20160427172335974; the Research Project of Shenzhen Health and Family Planning System, No. 201401077

Cite this article: Wang SX, Yang H, He LM, Hong WX, Zou HY, Xu YP. Accurate determination of HLA ambiguous results based on group-specific haploid full-length sequencing. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(20):3208-3215.

0 引言 Introduction

人白细胞抗原(human leukocyte antigen ，HLA)基因是迄今为止人类最复杂的遗传系统之一，具有高度的多态性。HLA 在器官移植和造血干细胞移植中起重要的作用，HLA 抗原相容性程度与移植效果密切相关，相合程度越高，移植物越容易存活[1-5]。目前以DNA 为基础的HLA 基因分型方法已被广泛应用，其中直接测序分析基础上的基因分型技术(PCR-SBT)是WHO 推荐的高分辨水平HLA 基因分型的金标准实验方法，可直接获得DNA 序列。但实际操作过程中，由于目的基因序列的特殊性、引物设计等多种因素，使得传统的PCR-SBT 金标准基因测序分型存在着模棱两可的结果[6-8]。

为了解决存在的模棱两可结果问题，深圳市血液中心与荷兰马斯特里赫特大学医学中心免疫移植和组织配型实验室以及深圳市晋百慧生物有限公司联合探索开发了HLA 全长测序分型试剂盒(组特异性单倍型PCR-SBT 法)，文章将对该方法作简要介绍并采用该方法对2例模棱两可结果标本进行确认分型，现报告如下。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 基因学实验。

1.2 时间及地点 于2016年12月在深圳市血液中心输血医学研究所实施，并于2017年1月完成。

1.3 材料 DNA 提取试剂盒(美国Gentra 公司)；A 、B 和DRB1座位PCR-SBT HLA 分型试剂(Atria 公司，批号A531C08，B514D08和R27L07)；PCR-SSPHLA 低分辨分

型试剂(G&T ，批号RF16)；HLA 全长测序分型试剂盒(组特异性单倍型PCR-SBT 法，深圳市晋百慧生物公司)；ABI 9700、ABI Veriti 96 型号PCR 扩增仪及ABI 3730型基因测序仪等实验相关仪器。 1.4 试验方法

1.4.1 试验原理 采用HLA 测序分型(PCR-SBT)方法，根据HLA-A 和-C 基因的组特异性分类，分别设计基因全长单倍型组特异性扩增引物对HLA-A 和-C 基因需要分型的外显子及内含子区域进行PCR 扩增；完成扩增后，为每个基因设计一套通用正反向全长测序引物对HLA 基因所有外显子及内含子进行测序。

本研究以低分辨分型结果作为参考和起点，可对HLA-A 和-C 所有等位基因进行测序分型，有效解决模棱两可，达到绝对高分，数据更加准确可靠。

1.4.2 HLA 位点PCR 扩增 按29 μL PCR 预混液和0.5 μL DNA 聚合酶的比例配置PCR 反应体系混合液，加1 μL 模板 DNA(20-100 mg/L)到相应的反应管，使最终PCR 反应体积为30.5 μL 。扩增程序：98 ℃ 2 min ；98 ℃ 15 s ，63 ℃ 15 s ，72 ℃ 4 min ，10个循环；98 ℃ 15 s ，60 ℃ 15 s ， 72 ℃ 3 min ，10个循环；98 ℃ 15 s ，57 ℃ 15 s ，72 ℃3 min ，10个循环；最后再72 ℃延伸 2 min ，4 ℃保存。扩增结束后，取2 μL PCR 产物，采用1%琼脂糖凝胶电泳的方法确认扩增效果，电泳可见清晰的条带时可进行纯化步骤。

1.4.3 PCR 产物纯化 每个反应孔加入60 μL 磁珠，吹打混匀。室温静置5 min 后放置于磁力架上，磁珠吸附1 min