华　中　科　技　大　学　博　士　学　位　论　文

期5例；有淋巴结转移52例，无淋巴结转移32例；肿瘤直径<3cm者40例，=3cm者44例。选取20例同期手术切除的正常肺组织作为对照组。对照组20例中男14例，女6例，年龄29~73(平均52.7)岁。所有肺组织标本均经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，所有标本连续切片厚4µm，均经病理确诊。

二、实验试剂

鼠抗人CAIX单克隆抗体(一抗)，浓缩型，R＆D公司产品，购自北京中山生物技术有限公司，使用浓度1:100，4℃冰箱保存；鼠抗人VEGF单克隆抗体(一抗)，浓缩型，购自北京中山生物技术有限公司，使用浓度1:100，4℃冰箱保存；S-P免疫组化试剂盒、DAB显色系统均购自北京中山生物技术有限公司；多聚赖氨酸防脱片剂，购自北京中山生物技术有限公司，4℃冰箱保存。用已知宫颈鳞癌CAIX阳性切片、膀胱癌VEGF阳性切片分别作阳性对照。按照SP试剂盒所附说明书进行操作。

三、实验方法

1、VEGF免疫组化步骤：

(1) 将切片脱蜡水化：PBS缓冲液冲洗3次，每次5min。EDTA高温抗原修复96℃15min；

(2) 双氧水阻断：用3% H2O2室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性；

(3) PBS冲洗3次，每次5 min；

(4) 血清封闭：甩去切片上的PBS缓冲液，每张切片上滴加50ul封闭液(正常山羊血清封闭非特异性位点，减少特异性结合)，湿盒内室温孵育15 min；

(5) 一抗孵育：倾去多余的血清，不洗，每张切片滴加50 ul 1:100稀释的一抗(兔抗人抗体)，置湿盒中，于4℃冰箱；

(6) 冰箱内取出湿盒在室温下复温30min，再用PBS缓冲液冲洗切片3次，每次5min；

(7) 二抗孵育：甩去切片上的PBS缓冲液，每张切片上滴加50ul生物素标记的二抗(抗兔的IgG抗体)，置于湿盒内，37℃孵育30 min；

(8) PBS冲洗3次，每次5 min；

(9) 甩去切片上的PBS缓冲液，滴加50ul链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，置

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