线粒体DNA提取方法的比较(2)

DNA提取

192 取上清后步骤相同。上清中加入等Eppendrof管中。

体积酚∶氯仿∶异醇(25∶24∶1),温和振荡8min,10000r min,10min4℃,取上层水相重复该

;扩增长度GGGAACATAATAATGGTCAC23′

248bp。扩增PCR标准反应体系在0.5mlEppendrof管中进行,反应总体积为50Λl。加入10

×buffer5Λl,MgCl2(25mmol L)3.6Λl,4×

1B(0.5Λl dNTP3.6Λl,引物1A Λg)各1.4Λl,模板(0.03Λg Λl)10Λl,PCR用水27Λl,石蜡油23Λl,95℃预变性220s,加入TaqDNA聚合酶0.9

过程抽提一次,轻取上层水相。加入2倍体积冰乙醇

或等体积异丙醇,冰浴30min,15000r min,10min,弃上清。用70%冰乙醇漂洗沉淀,15000r min,2min,彻底去上清。沉淀于空气中自然部分干

燥25min,加入适量RTE液溶解。贮于4℃。114　mtDNA样品鉴定

1.4.1紫外分光光度法测定　样品经适当稀释,用BECKMANDU7500紫外分光光度计定量。1.4.2琼脂糖凝胶电泳　电泳用DYY2 2型电泳

Λl。循环条件,95℃变性40S,55℃退火30S,72℃延伸36S,反应30个循环,最后72℃延伸10min.用DYY2 2型电泳仪,2%琼脂糖凝胶,取4Λl溶液与1ΛL上样液混和后点样,与BD2000Marker比较,100V4min,55V35min后紫外灯下观察、拍照,并

仪,0.7%琼脂糖凝胶,取6Λl溶解液与2Λl上样液

混匀后点样,与ΚDNA BamH Marker比较,100V4min,50V60min,紫外灯下观察并拍照。1.4.3聚合酶链反应(PCR)检测　以改进高盐沉淀法所提取mtDNA样品作为模板,测定线粒体DNAATPase8亚基基因序列。2个引物由上海博亚生物工程公司设计,1A:5′2

;1B:ACAATGACATGCCACAAC23′

进行DNA序列测定。2　结果

211　mtDNA的紫外吸收光谱分析

mtDNA样品浓度在0.3～1.3Λg Λl之间。

～.,改进高盐沉淀OD260 280在1.78,Triton法

1)θ±s,n=8)表量的比较(x

Triton法

mtDNA量()

0.21±0.02

碱变性法

0.30±0.023

高盐沉淀法

13.29±0.8833

　　　　　　　　　　　　　　注:3P<0.05(碱变性法与Triton法比较),

　　　　　　　　　　　　　　　33P<0.01(高盐沉淀法与Triton法比较);　　　　　　　　　　　　　　　 P<0.01(高盐沉淀法与碱变性法比较)

212　mtDNA琼脂糖凝胶电泳分析

3种方法所提取mtDNA样品电泳后,均可见

16.3kb的单一mtDNA条带(图1)。改进高盐沉淀

法提取mtDNA电泳条带最亮,Triton法的最弱。

图1　3种方法提取mtDNA琼脂糖凝胶电泳图　　　　　图2　ATPase8基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳　　　A、E泳道为ΚDNA BamHIMarkers,　　　　　　　　A、B泳道分别为BD2000Marker,248bp产物　　　B、碱变性法、C、D泳道分别为高盐沉淀法、　　　Triton法提取ntDNA。

213　PCR产物分析

扩增产物图谱为248bp左右片段(图2)。送上海博亚生物工程公司测序,将测序结果经计算机GenBank查询,发现与Wistar大鼠mtDNAATPase8亚基基因同源性在99%,确定为线粒体基因,位置为7735～7983。

3　讨论

自Anderson用氯化铯密度梯度分离得到线粒

体DNA后,有人参考Tamura和Palva提取动物组织mtDNA的方法,结合碱变性法提20kb以下质粒DNA原理,提取了人肝组织中mtDNA。胡义德