线粒体DNA提取方法的比较

DNA提取

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论　著 　

线粒体DNA提取方法的比较3

李伟文　陆松敏　刘建仓　武　凡　李　萍　柏干荣

第三军医大学野战外科研究所(重庆,400042)

　　摘要　目的将提取线粒体DNA的碱变性法、改进高盐沉淀法加以比较,以得到最方便快速提取线Triton法、粒体DNA的方法。方法分离Wistar大鼠小肠上皮细胞,用3种方法提取线粒体DNA,紫外分光光度法定量。用琼脂糖凝胶电泳和线粒体ATPase8亚基基因PCR扩增产物鉴定所提取的线粒体DNA。结果改进高盐沉淀法线粒体DNA量最多,Triton法最少。OD260 ～1.85间。将改进高盐沉淀法提取线粒体DNA用于OD280均在1.78结论改进高盐沉淀法提取线粒体DNA具有操作简单,PCR扩增,测定出了线粒体DNAATPase8亚基基因序列。产量多的优点,该法所提取mtDNA可用于mtDNA测序。

关键词　线粒体;DNA;分子遗传学

　　1981年,Anderson用氯化铯密度梯度分离得到线粒体DNA(mtDNA),进行了全序列分析。此后,mtDNA的研究日益得到重视。本实验将Triton法、碱变性法与改进高盐沉淀法进行了比较,发现后者具有简便、经济、易重复等优点。1　材料和方法111112　细胞分离

大鼠颈椎脱臼处死,30cm。先用37,注入0.25%枸盐酸结扎两端,置于,恒温摇床50r

弃内容液,分为8段,每段加含0.02%,in。

.37℃恒温摇床100r EDTA生理盐水2mlmin,35min,轻轻挤压一遍,100r 收集肠内min,5min。

琼脂糖系Promega产品,其它生化试剂系国产分析纯。

①溶液 :含Tris2HCl10mmol L,NaCl10mmol L,MgCl25mmol LpH7.5;

容液,加入约12ml生理盐水,2500r min,10min,

弃上清,沉淀再加入生理盐水,2500r min,5min.重复洗涤一次.计数后进行mtDNA提取。113　mtDNA提取及纯化

1.3.1Triton法[1]　取107细胞沉淀,悬浮于5ml

②溶液 :Tris2HCl10mmol L,NaCl400

mmol L,EDTA2mmol LpH8.0;

③溶液A:含50mmol L葡萄糖,25mmol LTris2HCl30mmol LEDTANa2,pH8.0;

的Triton溶解液中。温和振荡片刻后,室温下放置10min。反应完毕的溶液以8000r min离心1min,

上清即为mtDNA。

1.3.2碱变性法[2]　取107细胞沉淀,依次加入溶

④溶液B:0.2mol LNaOH含1%SDS(临用前用5mol LNaOH和10%SDS贮存液配制);

⑤溶液C:3mol L醋酸钾溶液,pH5.4,含5mol L醋酸根离子;

液A(4℃)150Λl,冰浴中将沉淀吹打分散后加入

300Λl溶液B(常温),将Eppendrof管缓慢颠倒10次,冰浴裂解变性6～8min,再加入225Λl溶液C(0～4℃),轻柔混匀,冰浴复性20～25min。反应完毕的溶液以10000r min离心6min,4℃,取上清。1.3.3改进高盐沉淀法[3]　取107细胞沉淀,加入溶

⑥Triton溶解液:含10mmol LKCl,15mmol LTris2HCl,pH8.3,　2.5mmol LMgCl2,1%V VTritonX2100;

⑦ΚDNA 7233、6770、BamH Marker16841、

6527、5256 5505bp;⑧BD2000Marker3000,2000,1000,750,500,200bp。

3

液 5500Λl,混匀,2000r 沉min,10min,弃上清。淀加溶液 5500Λl,混匀,3500r min,10min,弃上清。沉淀加溶液 950Λl,混匀后加入20mg ml蛋白酶K50Λl和10%SDS120Λl,快速混匀。40℃过夜或50℃4h。加入300Λl饱和醋酸钠,混匀,轻摇15S。15000r min,4℃,15min,取上清于

国家“九七三”项目资金资助(G1999054202)