酶工程简介

Fujii等将DNA滚环扩增的原理应用于易错PCR技术，创建了易错滚环扩增法(error—prone rol1ing circle amplification，EP—RCA)。其主要步骤：①随机引物六聚体(经硫代磷酸化修饰)杂交到环状DNA上，在φ29 DNA聚合酶(并加入Mn2+ 提高突变)的作用下多位点同时扩增延伸；②利用φ29 DNA聚合酶具有高的链置换活性的特点，以环状DNA为模板不问断扩增释放产生具有多重模板序列的DNA分子；③以线性DNA为模板继续扩增形成长短不一的线性产物，可直接用于转化，利用首尾重复序列在宿主内同源重组重新环化。

该法省去了酶切、连接等步骤，甚至不需要特定引物和PCR仪等设备(常温扩增)。不仅简化了进化过程，也使得随机突变技术的应用变得更为普遍。Fujii等利用EP—RCA法对pUC19质粒上的β-内酰胺酶(头孢氨苄抗性)进行改造，经一轮进化获得7个水解头孢他啶的突变体，改变了β-内酰胺酶的底物选择性，具有较高的突变率与突变谱。

2.8 复合自组装基因组工程

复合自组装基因组工程(multiplex automated genome engineering，MAGE)是以整个染色体DNA为模板，在体外设计并合成一系列的小分子DNA片段，通过转化的方法不断导入细胞内，随着染色体DNA的复制来构建突变库的方法。其主要原理：①在细胞生长对数期诱导细胞体内的β-蛋白表达(防止寡核苷酸降解)，制备细胞悬液；②针对特定代谢途径的相关基因设计一组约90 bp左右的单链小片段DNA；③通过电转化的方法把在体外合成的单链小片段DNA导入细胞中；④单链DNA可作为随机引物渗人染色体复制，造成基因的突变，细胞再生后可进行下一轮循环或筛选。

该方法的优点是效率高，既可以对细胞的整个代谢途径进行突变，也可以通过小片段DNA的设计重点突变基因组中的某些代谢途径。

3．酶分子定向进化的应用

通过定向进化对酶进行改造，在研究酶的构效关系，提高酶热、酶活性、或有机溶剂的稳定性，改变底物特异性等方面得到了广泛应用。

如张建云等利用易错PCR技术对OL淀粉酶基因进行了改造，通过多轮诱变，获得的5株新菌株的酶活分别为出发菌株的5～15倍。

Nakazawa等 通过易错PCR和活性筛选的方法得到β-l，4 -葡聚糖酶突变体2R4，其表达量比野生型提高了130倍， (最适条件下1 mol底物1 S内转化的酶量)提高了1.4倍， 值提高2倍，并且比野生型具有更大的pH稳定性，在55℃保温30 min可保留全部活性，而野生型活性完全丧失。

Kim等对栖热菌(Thermus sp．)IM6501菌株中具有热稳定性的麦芽糖淀粉酶进行了DNA改组，经过4轮改组和筛选，得到了具有高耐热性的麦芽糖淀粉酶。Ness等针对同源性在56％～99％之间的26个枯草芽孢杆菌蛋白酶基因进行了改组，获得了热稳定性提高3～15倍的克隆子。

Morawski等通过DNA改组获得1株辣根过氧化物酶突变体，该突变体能耐受较高浓度的双氧水、CTAB和其他盐类。但一般情况下通过单个定向进化技术构建的突变体库中包含的有益突变的比例较小，不利于后续的筛选和鉴定，目前已很少单独使用单一方法进行定向进化。一般的方法是将多种技术结合起来，从而得到更好的效果。

Miyazaki等 利用随机突变、饱和突变和DNA shuffling相结合的方法对Bacillus subtilis家族的木聚糖酶进行改造，改造后的木聚糖酶半衰期失活温度及最适反应温度比野生型提高了10℃，60 保温2 h仍保留全部活性，而野生型在6O℃保温5 min就完全失活。Shi等通过易错PCR和DNA shuffling的结合创建突变体库，筛选到 一琼脂糖酶突变体s2，s2的 值提高了4.6倍，在40℃时的半衰期为350 min，比野生型提高了18.4倍。

Song等利用随机突变和重组的方法筛选得到的3株磷脂酶A1突变体，其稳定性和活性都得到了较大的提高。此外，作为定向进化的延伸，基因组改组也已成为了菌种选育的有力