酶工程简介

的有益突变。

在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部，属于无性进化，但使用该方法易出现同型碱基转换。易错PCR使原始蛋白质中仅有较小的序列空间发生突变，当片段超过800bp时，其突变率会下降。

2.2 DNA重排技术

DNA重排技术(DNA shufling)，又称DNA改组技术，是从正突变基因文库中分离得到的同源DNA，用酶切成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。

DNA重排技术是由Stemmer等于1994年创建的。他们通过该技术对β-内酰胺酶进行了定向化研究，是该酶的催化效率提高了32000倍。

该技术将存在于两种或多种不同的基因中的正突变结合在一起，通过DNA碱基序列的重新排布，形成新的突变基因，属于有性生殖。

2.3 交错延伸PCR技术

交错延伸PCR(staggered extension process，SEP)技术：即在同一反应体系中以两个或多个相关的DNA片段为模板进行PCR反应，把PCR反应中常规的退火和延伸合并为一步，并且大大缩短了反应时间（55℃,5s）。在反应过程中，引物先与一个模板结合，进行延伸，随之进行多次变性和短时的退火——延伸反应循环，在每个循环中，不同长度的延伸片段在变形时与原先的模板分开，退火时与另一个模板结合，再进行延伸。通过在不同的模板上交替延伸，所合成的DNA片段中包含有不同模板上的信息，直到获得全长的突变基因为止。

采用交错延伸PCR技术进行酶的有性进化，可以省去DNA重拍技术中DNase Ⅰ切割这一步骤，具有简便、快速的特点

2.4 随机引物体外重组技术

随机引物体外重组技术(random-priming in vitro recombination，RPR)是采用单链DNA为模板，配合若干条随机序列的引物进行PCR反应，产生若干个与模板不同部分的序列互补的短DNA片段，然后除去模板，这些DNA小片段互为模板和引物进行扩增，通过碱基序列的重新排布而获得全长突变基因。

RPR具有以下特点：①可用单链DNA或mRNA为模板。对模板量要求少，减少了亲本组分的干扰；②克服了DNA shuffling中DNaseⅠ所具有的序列偏爱性，保证了子代全长基因中突变和交叉的随机性；③片段组装体系与片段合成体系缓冲系统可兼容，无需中间的纯化步骤。

2.5 过渡模板随机嵌合生长技术

过渡模板随机嵌合生长技术(random chimeragenesis on transient templates，RACHITT) 是基于DNA同源重组原理而实现的随机突变技术，是将随机切割的基因片段杂交到另一个相同家族的DNA临时模板上进行排序、修剪、空隙填补和连接，消化掉DNA临时模板，复制出新生的DNA链分子，从而建立高度重组的突变体文库的过程。

2.6 随机插入／删除链的交换突变技术

Murakami等创建了随机插入／删除链的交换突变技术(random insertion／deletion strand exchange mutagenesis，RAISE)。其主要步骤是：①用DNaseⅠ切割目的基因并回收100—300 bp小片段；②用末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)在小片段的3 端随机添加／删除几个核苷酸；③自引物PCR重组小片段直至扩增出全长基因。特点是简便并且可以通过控制插入或删除的核苷酸长度来调整突变程度。利用此法对 一内酰胺酶进行进化，显著提高了对头孢他啶(cefiazidime)的降解能力，其最小抑制浓度提高了5 000倍。

2.7 易错滚环扩增法技术