根据GenBank中报道的猫白介素-18基因(IL-18)序列,对用ConA刺激的实验猫外周血单核细胞(PBMCf)进行了RT-PCR扩增;将扩增得到的PCR产物纯化后克隆入pMD18-T中得到重组质粒pTIL-18,进行核苷酸序列测定,并与不同物种的IL-18基因进行了序列比较。结果该基因全长579bp,编码1

200农 业 生 物 技 术 学 报 2007 年

均为 100%。用 SignalIP 软件分析表明， 在推导的猫

氨基酸序列中没有信号肽； PROSITE 软件分 析， 也没有发现潜在的 N­ 联糖基化位点， 但存在 4 个 Cys 残基， 推测可能会形成二硫键结构。在氨基 酸序列比较时，发现猫

分子上存在有

分

即 phe­x(12)­phe­x­ser­x 子类似的特征性序列结构，

和推导的氨基酸序列的同源性分布为 89.8%、

88.6% 、 88.4% 、 88.1% 和 90.6% 、 88.9% 、 85.2% 、

但与小鼠 的差异较大， 核苷酸的同源 84.9%；

性在 66.1%左右，推导的氨基酸序列的同源性为 与鸡 66.5%； 约为 30.1%。

的差异很大， 核苷酸序列同源性

(6)­phe­leu（ x 代表相对变化的氨基酸）

。 图1.Fig.1.AmplificationofM， DL­15000+2000 1， negativecontrol 2and3， feline 

gene.

图 2. 重组质粒 pET的酶切鉴定

Fig.2.Identificationofrecombinantbyenzyme 

digestion 

M,DL­15000+2000 1and3,non­recombinant玉

芋；

2,4,5and6,recombinant玉芋. 

2.4 猫 IL­18 成熟蛋白氨基酸序列二级结构与三级 结构预测

用 HNN软件对猫 IL­18 二级结构预测表明， 猫

IL­18分子包括 3 段 琢­  螺旋，中间由无规则圈曲相

连接 （图 3）； 用 Swiss­model 软件进行三级结构预测 表明，猫 IL­18 三级结构是由无规圈曲连接的多段 平行的 琢­  螺旋所形成中空状的桶样结构 （图 4）。 2.5 不同物种 基因的遗传进化分析

序列分析表明， 猫

基因与犬、 羊、 牛和猪

等哺乳动物的

同源性相对较高(图 5)， 核苷酸

图3.猫 IL­18二级结构分析

Fig.3.Thesecondstructureanalysisoffeline

IL­18by 

hierarchicalneuralnetwork(HNN)method 

图4.猫 IL­18氨基酸序列 3D结构分析

Fig.4.3DstructureanalysisoffelineIL­18aminoacidsequence 

2.6 的构建

以重组质粒 pET为模板， PCR 可扩增出

目的基因片段（图 6）； pET用

芋与预期结果相一致， 双酶切，

可得到 5369表明该重组质粒构建正确。 和 579bp2 个片段 玉（图 和 7），

2.7 猫

基因在

中的表达及其检测

经 SDS­PAGE 分析， pET转化菌的诱导产

物在约 27.5kD处有 1 条特异的蛋白带（图 8 箭头 处）， 与预期值大小相符； 而 pET­28a(+)转化菌的诱 导产物和 pET

转化菌的非诱导产物在该处没