根据GenBank中报道的猫白介素-18基因(IL-18)序列,对用ConA刺激的实验猫外周血单核细胞(PBMCf)进行了RT-PCR扩增;将扩增得到的PCR产物纯化后克隆入pMD18-T中得到重组质粒pTIL-18,进行核苷酸序列测定,并与不同物种的IL-18基因进行了序列比较。结果该基因全长579bp,编码1

第 2 期 乔 军等：猫白介素 ­18基因的克隆、 序列分析及其表达

199

IL­12 家族，

除能诱导 INF­酌大量分泌， 还可促进 T、 B 淋巴细胞的分化、激活 NK 细胞以及诱导产生

IL­22等, 在抗微生物感染和肿瘤免疫中具有重要的 作用 （Dinarello， 1999； Zhang， 1999； Lebel­Binay 2000）

。鉴于 IL­18 具有广泛的生物学活性和潜 在的开发前景(Biet 

， 2002 Ohkusu 2000)，

因此成为众多细胞因子中的研究热点之一。 虎、 狮和 豹等均属于国家重点保护的大型猫科动物，积极开 展猫 IL­18 研究对于珍稀猫科野生动物病毒性感染 的防治具有重要的意义。本实验对猫

基因进

行扩增及序列测定， 并在大肠杆菌中进行了表达。

1 材料和方法

1.1 主要试剂、 质粒及菌株 

DNA 聚合酶、 DNAgelExtractionKit 和 dNTPs 购自上海生物工程公司。 TrizoL 购自

Invitrogen 公司 （美国)。反转录酶 M­MLV、 RNasin、 T4 DNA 连接酶、

限制性内切酶和 pMD18­T 载体购 自大连 TaKaRa 公司。DMEM培养基为 GIBCO（美 国) 产品；大肠杆菌表达载体

pET28a(+)、

克隆宿主菌 JM109 和表达宿主菌 BL21 (DE3)由本室保存。

1.2 猫外周血淋巴细胞的制备及总 RNA 的提取

对健康的实验猫进行心脏采血，

肝素抗凝， 用淋 巴细胞分离液分离猫外周血单核细胞 （PBMCf）， 用

Hank's 液洗涤 3 次后进行计数，调整 PBMCf 至

1.5伊10  6 个 /mL， 用 DMEM 培养液 （内含 8％的牍牛 血清， 10mg/LConA(A 伴刀豆球蛋白)以及青、 链霉 素 1000IU/mL） 进行培养。37 ℃下培养 24h 后， 用

TrizoL 按常规方法提取 ConA 刺激后 PBMCf 的总 RNA。

1.3 引物的设计与合成

根据 GenBank 中已发表的猫 cDNA 序

列, 设计了 1 对特异性引物 P1 和 P2， 预期扩增长度

为 579bp。

上游引物P1: 

5'­ACCGAATTCATGAGAATTTCGAAACCGTATCTGAG­3'

下游引物P2: 

5'­ACCAAGCTTTCAAGGAGAATTGATGAACATTTG­3'。

为下一步克隆需要， 分别在上、

下游引物中引入 玉和 芋酶切位点，并加有 3 个保护性碱 基。引物由大连 TaKaRa公司合成。

1.4 猫

基因 RT­PCR 扩增、 克隆及序列测定

以提取的总 RNA为模板，以 P2 和 Oligo­T 为 引物按常规方法用反转录酶 M­MLV 进行 RT 反 应。取 RT 产物 2 滋L ， 10伊PCRbuffer5 滋L 、

25 mmol/LMgCl 2 4 滋L

 、引物 P1（25pmol/滋L ）、 P2（ 25 pmol/滋L ） 各 1 滋L ， 2.5mmol/LdNTPs 4 滋L ， 水 32.7 滋应条件为： L DNA96 聚合酶 ℃预变性 （5U/200 滋Ls ； ） 94 0.3℃ 滋,40L 混匀。

s 56 ℃PCR,30 反 s  

72 ℃,50s， 35 个循环；然后 72℃ 再延伸 10min。 PCR 产物用 1.2%琼脂糖凝胶电泳分析。切下目的 DNA 片段，按凝胶回收试剂盒进行回收。取回收 DNA 片段，

与 pMD18­T 载体 16 ℃连接过夜； 将连 接产物转化大肠杆菌 JM109， 然后用 Amp 琼脂平板 上筛选， 并用限制性内切酶酶切和 PCR 方法鉴定获 得重组质粒 （命名为 pET， 送上海联合基因生

物公司进行序列测定。所测序列用 DNAMAN 和

DNAstar 软件分析，并 对不同生物物种 基因

进行遗传进化分析。 1.5 的构建

用

玉和 芋同时分别双酶切 pET和 pET28a， 然后回收目的片段和载体片段， 用 T 4 连 接酶连接进行定向克隆，构建原核表达载体

pET并用酶切和 PCR 进行鉴定。

1.6 在大肠杆菌中的表达及表

达产物的鉴定

将 pET转化于感受态菌 BL21(DE3 )后，

挑 选单菌落， 接种含卡那霉素 （30mg/L） 的 LB 培养基 中， 37 ℃摇荡培养至

0.6~1.0， 加 IPTG（终浓

度为 1mmol/L）诱导 6h。离心收集菌体，重悬于 200 滋L TE 中, 加等体积 2 倍 SDS 凝胶加样缓冲

液， 100 ℃煮沸变性 5min，在 12%的凝胶上进行 SDS­PAGE 电泳以检测目的蛋白的表达，并用双波 长非点扫描仪对上述凝胶电泳的蛋白带进行扫描。

2 结果

2.1 猫

基因 RT­PCR 扩增结果

经 1.2%琼脂糖凝胶电泳 , 猫

基因

RT­PCR 产物为 579bp，

与预期结果相符 （图 1）。 2.2 的鉴定

以重组子 pET为模板，用 PCR 方法进行 鉴定， 可扩增得到 579bp 的核酸片段， 与预期的一

致。将重组质粒 pET用

玉和 芋双酶 切， 可得到 2692 和 579bp2 个片段， 与预期结果一 致 （图 2）， 表明目的基因已克隆到 T 载体中。 2.3 猫 基因 cDNA 序列测定结果及推导的氨

基酸序列

经序列测定表明, 猫

cDNA 的阅读框全

长 579bp，编码 192 个氨基酸。此信息已被 Gen­ Bank 收录， 登录号为 DQ100372。与 GenBank 中报 道的猫

相比，两者核苷酸和氨基酸的同源性