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黄豆３０ｍｉｎ灭菌；产酶培养基（即黄泔水培养基）

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大生长点。

粉３０９，蔗糖３９，硫酸镁２９，磷酸二氢钾２９，淀粉４９，补黄泔水ｌ０００ｍＬ，１１３℃、３０ｍｉｎ灭菌。

１．２培养方法

将２８℃培养２４ｈ的斜面菌体取一环接种于种子培养基中，２８℃、２００ｒ／ｍｉｎ下振荡培养２４ｈ，以６％接种量接种于产酶培养基中，２８℃、２００ｒ／ｍｉｎ下振荡培养，进行测定。

１．３粗酶液的制备

用５ｍＬ的移液枪吸取３．０ｍＬ种子培养液到装有５０ｍＬ发酵培养液的三角瓶中培养，接种量为６％，于２８℃，２００ｒ／ｍｉｎ条件下振荡培养。过滤，取菌丝体称重，用玻璃匀浆器把菌体细胞破碎后稀释，作为粗酶液。

１．４酶活力测定方法

蛋白酶活力的测定参照福林酚法进行Ｈ１；纤维素酶活力的测定参照３，５一二硝基水杨酸（ＤＮｓ）法进行¨１；脂肪酶活力的测定参照橄榄油乳化液水解滴定法进行Ｍ１；仅一淀粉酶活力测定参照碘量法进行ｏ¨；ａ一半乳糖苷酶活力测定参照比色法进行¨１；谷氨酰胺酶活力测定参照Ｎｅｓｓｌｅｒ法进行一ｏ。

２结果与分析

２．１

高大毛霉ＭＨＣ一７的生长曲线和孢子悬液显微

镜检图

将种子培养液接种到有５０ｍＬ发酵培养液的三角瓶中培养，接种量为６％，于２８℃，２００ｒ／ｍｉｎ条件下振荡培养。隔１２ｈ取两瓶离心，弃上清液，把沉淀用蒸馏水洗两次，然后抽滤到已知干重的滤纸上，置烘箱中６０℃烘１２ｈ，称量总重，算出菌丝体干重，最后绘制生长曲线。

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发酵时间（ｈ）

图ｌ高大毛霉ＭＨＣ一７的生长曲线

在麸皮固体培养基和黄泔水液体培养基进行前期培菌的过程中，发现毛霉ＭＨｃ一７在黄泔水培养基中在２４～３６ｈ的生长速率最快，在３６ｈ时菌丝生物量达到最高点，这主要表现为生物量的急剧上升、培养基的迅速浑浊。而按照传统的生产指标，ＭＨｃ一７在麸皮培养基上需要生长３～４ｄ。而最为重要的是在制作菌种悬浮液的时候发现，液体发酵所产生的孢子数明显多于固体发酵，生长周期大约为３６ｈ，比固体培养大大缩短了培养时间。固体培养毛霉生产腐乳稳定性差，液体培养的毛霉产孢子量多，易操作，不易污染，有利于提高腐乳的质量。高大毛霉ＭＨｃ一７的生长曲线和孢子悬液显微镜检图可以为后面的实验提供基础数据，测试酶活时可参考生长曲线的最

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２．２黄泔水发酵培养基的优化

以蔗糖、淀粉作为碳源，黄豆粉、黄泔水作为氮源，硫酸镁和磷酸二氢钾作为无机盐，按ｋ（３４）设计四因素三水平实验。九个组合，三次重复，采用２５０ｍＬ摇瓶培养，见表１。

表ｌ实验因素及水平

由极差分析（表略）可以看出，在此培养基成分及浓度范围内，影响ＭＨｃ一７毛霉蛋白酶活力的主要因素是蔗糖，其次是无机盐。方差分析（表略）显示，蔗糖、无机盐均为极显著因子，黄豆粉和淀粉为显著因子。从实验数据可以看出，在一定范围内，随着蔗糖浓度的增大，蛋白酶活力有所降低。通过正交实验得出ＭＨｃ一７发酵最适液体培养基为黄豆粉３％、可溶性淀粉Ｏ．４％、硫酸镁Ｏ．２％、磷酸二氢钾０．２％、蔗糖Ｏ．３％和黄泔水。

２．３

ＭＨＣ一７蛋白酶、ａ一淀粉酶、ａ一半乳糖苷酶、谷

氨酰胺酶、纤维素酶、脂肪酶活力曲线

从图２一图７中可以看出，ＭＨｃ一７在黄泔水液体培养状态下，３６ｈ是菌体产蛋白酶的高峰期，在这期间蛋白酶活力急速上升，之后活力开始减弱；瑾一淀粉酶、ａ一半乳糖苷酶、谷氨酰胺酶分别在４８、４２、４８ｈ时达到最大值，随后酶活力逐渐下降；纤维素酶和脂肪酶从７２ｈ内酶活力一直呈上升趋势，由于实际生产需要一般发酵都不会超过７２ｈ，所以没有对这两种酶再继续测定。

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时间（ｈ）

图２蛋白酶的生长曲线

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图３

ａ一淀粉酶的生长曲线

３讨论

ＭＨＣ一７在液体培养基中生长的速度要明显比在传统固体培养基中快，缩短生产周期，这样，在相同的时间内，可以培养更多的毛霉菌，提高了腐乳企