氨基酸分析测定及衍生化方法_吕莹果(3)

HPLC 的使用之一

FMOC–Cl能同时与一级和二级氨基酸反应，反应迅速，可在30 s内完成；衍生产物需迅速用戊烷萃取，萃取所得化合物稳定，在室温可稳定保存13 d。试剂本身及其水解产物（FMOC–OH）有荧光，对色谱分离会产生一定干扰；与组氨酸形成衍生物不稳定，影响定量。

3.4 6–氨基哇琳基–N–琥珀酰–亚胺基甲酸酯

6–氨基哇琳基–N–琥珀酰–亚胺基甲酸酯（6– aminoquinolyl–N–hydroxy–succinimidyl carbamate，简称AQC），是一种较新柱前衍生试剂，也是近年应用较为广泛氨基酸柱前衍生试剂之一。AQC与氨基酸反应迅速，反应方程式如图4所示。衍生产物既可用紫外检测，检测波长254nm；也可用荧光检测，激发波长250nm，发射波长395nm。

到最大产率。衍生产物荧光易因缓冲液淬灭，衍生产物不太稳定，需在密闭和避光条件下反应，且衍生完成后需立即进样分析，易生成多级衍生物；如组氨酸与Dansyl–Cl反应产物易形成双峰，重复性较差。3.6 邻苯二甲醛

邻苯二甲醛（o–phthaldialdelhyde，简称OPA），能在还原剂巯基乙醇存在下与一级氨基酸反应生成具有很强荧光异吲哚衍生产物，反应迅速，在室温下1 min即可完成，反应产物激发波长350~360 nm，发射波长450 nm，具体反应方程式如图6所示。

OPA衍生氨基酸反应特点如下：

优点：OPA本身不发荧光，色谱分离中不会形成干扰峰；OPA与硫醇试剂联用和一级氨基酸反应迅速，易于实现在线自动化。仪器设备简单，普通实验

AQC可同时与一、二级氨基酸反应，实验操作简单、反应时间短；且衍生产物稳定，定量准确；衍生缓冲液适用范围宽，一般为8.2~9.7；但衍生试剂水解产物影响分离。此外，当样品中存在羟基脯氨酸和羟基赖氨酸时，反应副产物会严重干扰定量〔25~26〕。3.5 丹磺酰氯

丹磺酰氯（Dansyl–Cl），也是近年常用氨基酸荧光衍生试剂之一。通常Dansyl–Cl与氨基酸反应，形成单酞化衍生物具有很强荧光，反应方程式如图5所示。衍生产物激发波长330 nm，发射波长550 nm，也可用紫外检测，检测波长250 nm。

室均可满足要求；衍生产物对柱损耗小。

缺点：OPA不能直接与二级氨基酸（脯氨酸和羟基脯氨酸）反应，需预先在NaClO等氧化剂作用下氧化开环，也可通过与FMOC–Cl联用方法衍生二级氨基酸。OPA与氨基酸衍生产物不稳定，衍生后需立即进样分析；胱氨酸衍生产物产量很低而不能被检出。3.7 2，4–二硝基氟苯

2，4–二硝基氟苯（2，4–dinitro–fluorobenzene，简称DNFB），在避光、60℃条件下，能与一、二级氨基酸同时反应生成一种稳定衍生产物，紫外360nm处有较强吸收，反应方程式如图7所示。

Dansyl–Cl可同时与一级和二级氨基酸反应；但衍生反应活性差，速度较慢，至少需要35 min才能达

DNFB衍生氨基酸反应特点：

优点：可同时与一、二级氨基酸反应；

衍生产物