氨基酸分析测定及衍生化方法_吕莹果(2)

HPLC 的使用之一

有吸收时，也可同时进行分离和检测；其主要缺点是衍生化条件自由度有所限制。由于衍生反应在特定反应器中进行，常造成色谱峰展宽，使分离度降低；过量试剂或试剂水解产物可能造成干扰；通常需要特定设备配件。

柱前衍生化，样品组分经特定化学反应，转变为发光或发色衍生物，再进行色谱分离测定。该法有以下优点：通常不考虑衍生化反应动力学，直到衍生反应完全；为使衍生反应及衍生产率获得最佳效果，可任意选定衍生化条件柱前衍生化反应的溶剂不必与分离时流动相相匹配；衍生化副产物可进行预处理以降低或消除其干扰。其主要缺点表现为：柱前衍生化反应形成副产物可能对色谱分离造成较大干扰，有时严重影响衍生化反应重复性；衍生物水解、反应溶剂杂质组分造成大量干扰峰〔17〕。

相比之下，柱前衍生法对仪器要求相对更低，且优点更为突出，普适性广，应用更为广泛。3 氨基酸柱前衍生化方法

近年来，柱前衍生RP–HPLC分析氨基酸得到迅速发展，RP–HPLC要求将氨基酸在柱前转化为适于反相色谱分离并能被灵敏检测的衍生物。柱前衍生关键在于衍生试剂选择，常用柱前衍生试剂一般需具备以下几个特点〔18~20〕：（1）摩尔吸光系数大；

（2）良好发光或发色性能，与被标示生物基质结合后特性不减弱；

（3）可与被标示物通过物理或化学作用结合，未结合标示剂及其水解产物易于清除或分离；（4）与背景对比明显，以避开杂质干扰，提高检测灵敏度；

（5）标记反应条件温和，确保被标示生物基质原有化学性质不被破坏；（6）易于合成、保存，无毒；

（7）形成衍生物在乙睛和甲醇中有足够溶解度；（8）衍生产物稳定性强。

根据以上要求，有几种常用柱前衍生化试剂，具体衍生化方法及结果评价如下。3.1 荧光胺

荧光胺（Fluorescamine，简称FA），1972年，Uden- Friend〔21〕等发现和茚三酮产物通过氧化脱羧后形成苯乙醛，在过量茚三酮存在下能迅速与氨基酸形成强荧光产物；随后鉴定这一中间体结构并命名为荧光胺，荧光胺与氨基酸反应方程式如图1所示。

PITC可与一级和二级氨基酸同时反应，衍生产物单一、稳定，冻干衍生产物–20℃可贮存30 d，4℃水溶液中可贮存3 d，色谱响应值无明显变化。但样品制备较为繁琐，需预先去除剩余试剂；且虽严格操作，但存在于样品中痕量PITC试剂也会缩短分析柱寿命。3.3 氯甲酸芴甲酯

氯甲酸芴甲酯（9–fluorenyl methyl chlorformate，简称FMOC–Cl），通常情况下，FMOC–Cl与氨基酸反应，生成一种具有强荧光产物FMOC–AA，反应方程式如图3所示。可用荧光检测，激发波长为265 nm，发射波长为310 nm；

也可用紫外检测。

通常情况下，一、二级氨基酸、醇、水等都能与荧光胺起反应，但只有一级氨基酸形成荧光衍生物。因此，该试剂具有一定选择性，能与一级氨基酸在pH 9和室温条件下瞬时反应，衍生产物具有高荧光强度；而试剂本身则迅速水解成不带荧光产物，不影响分析，是一种理想柱前衍生化试剂。其荧光激发波长390 nm，发射波长475 nm〔22~23〕。3.2 异硫氰酸苯酯

异硫氰酸苯酯（Phenyl isothiocyanate，简称PITC），早期主要是作为异硫氰酸甲酯替代物出现〔24〕。随衍生氨基酸技术不断完善，近年来，PITC法已成为普遍用于RP–HPLC分析氨基酸方法之一。室温下，PITC与氨基酸反应生成苯氨基硫甲酞衍生物（PTA–AA），在原有氨基酸结构中引入苯环，使氨基酸极性大大降低，衍生反应可在5~10 min内完成，反应方程式如图2所示。由于试剂具有挥发性，所以需用过量试剂进行反应，反应后剩余试剂通过减压蒸馏去除，再进行色谱分离。