Red重组系统用于大肠杆菌基因修饰研究进展(4)

时间：2026-01-18

复苏产生更多转化子的原因。在操作过程中,复苏后取一定的菌液涂布后,可将剩余的菌液继续培养过夜,如初次复苏没有得到转化子,可以继续涂布过夜培养的菌液。

白光兴等(2005)根据试验得出L 阿拉伯糖在浓度高于120mmol/L时,细菌生长会受抑制,而诱导时间要在40min以上才能保证重组效率。

我们根据国内外文献报道,对L 阿拉伯糖的诱导浓度作了优化。分别用不同浓度的L 阿拉伯糖诱导Red重组酶表达。实验证明,感受态细胞在浓度为100mmol/L的L 阿拉伯糖诱导后,可得到更多重组子。最终确定,L 阿拉伯糖诱导时间为90min,37 复苏2h。此外,同源重组后的菌株,需要电转入pCP20用以消除抗性基因。我们的试验结果表明,将pCP20转化进重组后的菌株中所长出的转化子有80%均为消除抗性基因的重组子,反敲效率较高。

的位置有关

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图5 sacB同源重组Fig.5 sacBrecombination

。如果改为短同源臂,就可以一次PCR

扩增出片段1,而片段2直接合成即可,大大节省了实

4 问题与展望

近年来,Red重组已经发展成为一套比较成熟的重组系统,以重组效率高和方法简便著称。对Red重组的改进方法主要是对Red载体系统的改造来提高其重组率。例如,Datta等

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验时间,增加了实验效率。

但是,这种方法同样存在缺点。第一次同源重组的效率较低,原因可能为,sacB基因在没有蔗糖存在的情况下对E.coli也有一定的毒性,第一次同源重组时,多表现为sacB失活的突变,从而导致添加蔗糖筛选消除sacB的重组子时出现假阳性。

Red重组技术虽然已比较完善,但是对于Red重组的某些更深层次的机理还有待研究,例如,虽然我们已经知道Gam蛋白可与RecBCD核酸外切酶结合,抑制RecBCD核酸外切酶活性,然而其精确的抑制机制还不清楚,有待进一步研究。

目前,Red重组技术大多数应用于大肠杆菌的基因修饰中。有人曾在沙门氏菌(Salmonella),痢疾杆菌(Shigellaflexneri)等菌中利用Red重组进行基因敲除,但在其它菌种例如枯草芽孢杆菌中,还是运用其自身的重组系统,难摆脱其重组效率低、操作复杂等缺点。所以,如何对Red重组系统进行改造,使其可以在大多数细菌中运用将成为今后Red重组的主要研究方向。随着基因工程研究的不断深入,Red同源重组作为一种高效的打靶技术,其应用范围将越来越广泛,将使基因修饰(尤其是基因敲除技术)技术的发展得到进一步的完善。

通过缺口修复和交换质粒原点

的方法构建了一套在革兰氏阴性菌中表达重组功能的质粒,这些质粒包括一个复制起点和由Red基因(exo,bet和gam)组成的噬菌体基因组片段。还有人在敲除一个基因的同时引入另一个基因,即基因敲入(geneknocking)。即在FRT位点抗性基因后连入一个要敲入的基因,与抗性基因一起重组到染色体上。但是,Red重组系统也有缺点。利用Red重组进行基因敲除后,会在目的菌株基因组的敲除位点留下几十至一百个碱基的外源片段,包括一个FRT位点。Zhang等

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将B.subtilissacB基因连在抗性基因上,通

过两次同源重组,分别用抗性和添加蔗糖来筛选重组子,可以在不引入外源基因的基础上敲除基因(图5)。这种重组方法需要两个DNA片段用于重组:片段1:同源臂#抗性基因 sacB#同源臂;片段2:同源臂#同源臂。Zhang等Mizoguchi等

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选用500nt长的同源臂,通过酶

切连接的方法构建出两个DNA片段。操作比较复杂。

通过overlappingPCR构建两个DNA片和Mizoguchi等

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段,虽然方法比前者简便,但是也增加了PCR的错误率。Zhang等

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参考文献