Red重组系统用于大肠杆菌基因修饰研究进展(3)

表1 引物同源臂长度

Table1 Thelengthofprimerhomologousarms

国内外文献报道Red载体系统白光兴等(2005)Serra等[11]Liu等

韩聪等(2004)Lee等

[13][12]

抗性模板pKD3######pFK3pKD3或pKD4

pKD3###

引物同源臂的长度

45nt280nt200~500nt

40nt48~58nt40~55nt36~50nt

pKD46pKD46BACspKD46pKD46pBR322 RedpKD46

陈伟等(2005)Datsenko等

[9]

酸外切酶活性,但由于其抑制作用并非完全抑制,RecBCD会留有一部分活性,而且体内还有其他核酸外切酶,例如,RecQ和RecJ。长度较短的同源臂容易被这些核酸外切酶降解,导致重组效率偏低

[14]

。

根据国内外有关文献报道,我们经过条件优化,将同源臂的长度设计为56nt,转化后长出的假阳性很少,转化子70%均为重组子,无论从转化子的数量及假阳性比例都可满足实验的要求。

由于用于同源重组的DNA片段为PCR产物,可能有模板的干扰而导致转化子假阳性偏高,通常用DpnI对PCR产物酶切。DpnI能对甲基化的GATC酶切,因为PCR产物不会甲基化,而模板一般为质粒或基因组,在体内会甲基化,所以用DpnI对PCR产物进行酶切以消除模板的干扰效果甚佳。

Red重组中感受态细胞的优劣也是影响重组效率的关键因素之一。许多文献都对制备感受态细胞时,L 阿拉伯糖的诱导浓度及诱导时间和转化后的复苏时间做了优化试验(表2)。 Serra Moreno等

[11]

通过试验发现,转入重组片段后

复苏3个小时,在37 复苏得到的转化子多于30 复苏的转化子。pKD46在37 生长时虽然会丢失,但其表达的蛋白仍可以继续维持进行同源重组,而大肠杆菌在37 的生长速度快于30 ,这可能是造成37

对于要敲除的目的基因,其引物同源臂的长度是影响重组效率的最主要原因。同源臂短,可能造成敲除的失败或产生大量的假阳性结果。同源臂越短,通过抗性筛选到的转化子的假阳性就越多;而同源臂过长,则会造成引物合成的成本几倍或十几倍增长且合成时间过长,影响研究进度。目前,国内外通过Red重组进行基因修饰所使用的引物同源臂长度主要在40~60nt之间(表1)。

同源臂的长度影响重组率的高低主要和菌体内的amecBCD表2 L 阿拉伯糖的诱导时间及浓度、转化后复苏的

时间及温度

Table2 TheconcentrationandL arabinoseanditsinducingtimeandrecoverytimeandtemperatureaftertranslation

国内外文献报道

L 阿拉伯糖

诱导浓度30mmol/L30mmol/L10mmol/L

L 阿拉伯糖

复苏时间复苏温度

诱导时间###60min90min######

1~3h60min1h###1h

37 37 30 ###30

Serra Moreno等[11]100mmol/L白光兴等(2005)付小花等(2007)

Lee等

[13]

韩聪等(2004)###