Red重组系统用于大肠杆菌基因修饰研究进展(2)

30 培养时可以正常复制,而高于37 时会自动丢失。在pKD46上还含有受ParaB启动子调控的exo、bet、gam基因,它们通过L 阿拉伯糖诱导表达,并携带氨苄青霉素抗性基因作为筛选标记(图1)

。

pRedET含有oriR101温度敏感型复制子,在30 复制。带有受pBAD启动子调控 噬菌体的red , ,!3个基因,通过L 阿拉伯糖诱导表达。pBAD同时受araC基因产物的正调控和负调控,araC作为转录阻遏物可以与L 阿拉伯糖形成复合物,从而启动转录。2.2 提供抗性片段的质粒pKD3/pKD4

pKD3含有氯霉素抗性基因,且在抗性基因两侧有FRT位点,常在Red重组系统中作为抗性标记使用。pKD4作用机理与pKD3相同,抗性标记不同于pKD3的氯霉素,为卡那霉素抗性(图2)。2.3 抗性基因消除质粒pCP20

pCP20含有温度敏感型的复制起点,同时带有氨苄青霉素和氯霉素抗性。pCP20上含有一个翻转酶重组酶(flipaserecombinationenzyme,FLP)基因,FLP重组酶可以与FRT位点结合,在FLP重组酶的作用下,FRT位点自身发生同源重组,从而消除一个FRT位点及抗性基因(图3)。重组酶FLP在42 时诱导表达,同时质粒也逐渐消失

[9,10]

图1 pKD46质粒图谱Fig.1 ThemapofpKD46

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图2 质粒pKD3(a)与pKD4(b)图谱Fig.2 ThemapofpKD3(a)andpKD4(b)

3 Red同源重组的技术方法及技术难点

Red重组系统共需要设计两对引物,即带同源臂的抗性基因扩增引物和鉴定引物。带同源臂的抗性基因扩增引物可以扩增两侧带有FRT位点的抗性基因片段,并在FRT位点的外侧加入同源臂,其扩增产物可以通过同源重组将抗性片段替换掉拟敲除的目的基因。具体的技术路线如图4。

与Rec同源重组方法相比,Red重组系统的同源臂,Red可以直接将同源臂设计在引物上,免去了添加酶切位点或重叠延伸PCR(genesplicingbyoverlapextensionPCR,SOEPCR)等操作。鉴定引物用于鉴定目的基因是否被成功地替换为抗性基因,通过PCR检测两个目的位点之间的距离判断菌体是否进行了重组,通常设计在同源臂外侧的基因上,但如果敲除基因片段与插入片段长度相似,则无法通过该方法进行检测。理论上,可以将鉴定引物分别设计在同源臂的内侧和外侧,但目前尚未有文献报道,可能是在PCR鉴定过程中无